維拉帕米介導食管癌細胞多藥耐藥及細胞凋亡的實驗研究

翁呈韜, 張騰躍, 劉亞貝, 樊高飛, 吳 旸 ,范平生

(安徽省腫瘤醫院 腫瘤內科, 安徽 合肥, 230031)

論著

維拉帕米介導食管癌細胞多藥耐藥及細胞凋亡的實驗研究

翁呈韜, 張騰躍, 劉亞貝, 樊高飛, 吳 旸 ,范平生

(安徽省腫瘤醫院 腫瘤內科, 安徽 合肥, 230031)

目的探討維拉帕米提高食管癌化療藥物敏感性及促進細胞凋亡的影響。方法采用CCK-8法檢測紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶對于4種食管癌細胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)的IC50值(IC501); 用維拉帕米(4.91 μg/mL)聯合上述化療藥物處理每種細胞, CCK8法檢測維拉帕米聯合上述化療藥物針對上述4種食管癌細胞株(EC109, EC9706, KYSE-450和TE-1) IC50值(IC502); 以前期實驗得出的VER逆轉化療耐藥能力差異最為顯著的一對食管癌細胞為研究對象, Annexin V-PI雙染法檢測食管癌細胞凋亡。結果紫杉醇在KYSE-450和EC9706的IC50值明顯大于EC109和TE-1, 順鉑在TE-1細胞中IC50值明顯小于其他3種細胞, 5-氟尿嘧啶在EC109中IC50值明顯高于在其他3種細胞。加用維拉帕米后, 4種食管癌細胞系(EC109, EC9706, KYSE-450和TE-1)針對紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶的IC50值均不同程度下降，提示維拉帕米均不同程度提高了上述3種化療藥物的敏感性。其中，順鉑組未加入維拉帕米前, EC109, EC9706, KYSE-450與TE-1相比，均存在不同程度耐藥性，加入維拉帕米后，針對EC9706 IC50值變化倍數較大(15.2倍)，提示逆轉敏感; 針對EC109IC50值變化倍數較小(1.6倍)，提示逆轉耐受。結論維拉帕米逆轉EC9706的阿霉素效率指數最高(15.2倍)，與EC109細胞相比有顯著性差異(1.6倍)。提示EC9706(DDP)對維拉帕米的逆轉敏感，而EC109(DDP)對維拉帕米的逆轉耐受。維拉帕米有可能通過促進細胞調亡途徑提高其逆轉化療耐受的能力，從而增強化療藥物敏感性。

維拉帕米; 食管癌; 耐藥性; 逆轉能力; 細胞凋亡

食管癌是臨床上常見的消化系統惡性腫瘤之一, 50%～60%的患者已為晚期腫瘤, 5年生存率僅為14%, 若存在遠處轉移，其1年內總體生存率不足50%[1]。晚期食管癌患者多釆用化療、放療結合手術的綜合治療，化療在其中起著重要的作用[2]。現有的化療藥物主要包括順鉑、5-氟尿嘧啶、紫杉類、去甲長春新堿、依立替康、希羅達等，多采用聯合化療的方法[3-4]。維拉帕米是一種臨床用于心臟疾患的鈣離子通道阻滯劑，研究[5-6]表明其具有逆轉腫瘤細胞多藥耐藥(MDR)的作用。為探討維拉帕米逆轉食管癌細胞的化療耐藥性，本研究擬通過檢測維拉帕米改變3種化療藥物(紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶)對4種食管癌細胞株(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)的IC50值的影響，篩選出維拉帕米逆轉敏感和逆轉耐受細胞株及對應用的化療藥物，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞株及實驗材料

食管癌細胞株(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)由本科實驗室留存; 紫杉醇(PTX, 揚子江藥業, 60 mg/支)，順鉑(DDP,江蘇豪森, 30 mg/支), 5-氟尿嘧啶(5-FU, 江蘇南通精華制藥, 0.25 g/10 mL), 維拉帕米(Verapamil, 上海禾豐制藥, 5 mg/2 mL), 由本院藥劑科提供; CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所; V-PI雙染細胞凋亡試劑盒購自武漢碧云天生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養: 人食管癌細胞株以含10%FCS的高糖DMEM培養液，在37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行常規培養，用0.25%胰酶消化處理對數生長期的人食管癌細胞株細胞, 24 h換液，當細胞呈單層致密狀分布時，用PBS沖洗, 0.25%胰蛋白酶消化后以1∶3傳代，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 化療藥物及維拉帕米給藥濃度: 化療藥物進行1∶4或1∶5稀釋，5-FU終濃度設置為200、40、8、1.6和0.32 μg/mL; DDP設置為0.25、1、4、16、64 μg/mL; 紫杉醇為0.25、1、4、16、64 μg/mL; 維拉帕米設置為1.5、3.0、6.0、12.0、24.0 μg/mL 的5個濃度梯度。

1.2.3 4種食管癌細胞系化療藥物耐藥特性的測定: 取對數生長期食管癌細胞 , 0.25%胰酶消化后用高糖DMEM制成單細胞懸液, 2×105個/mL細胞密度接種于96孔培養板中(100 μL/孔)，置37 ℃, 5%CO2孵箱內培養12 h。加入用高糖DMEM稀釋的不同濃度的化療藥物，每個劑量設3個復孔(對照組分為PBS處理組和空白對照組)，培養72 h后，再加入CCK8試劑(10 μL/孔)，培養1 h后，以PBS處理組為對照，測定每組的OD450值，以藥物濃度為橫軸, OD450為縱軸，繪制濃度-效應曲線，確定半數抑制濃度(IC501)。實驗至少重復3次。

1.2.4 維拉帕米逆轉腫瘤細胞耐藥實驗: 用固定濃度的維拉帕米(4.91 μg/mL)聯合化療藥物處理每種細胞, CCK8法檢測該化療藥物針對4種食管癌細胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1) IC50值(IC502)。

1.2.5 維拉帕米逆轉化療藥物耐藥能力判定: 維拉帕米逆轉化療藥物耐藥效率指數，以IC501/IC502結果判定，值越大說明能力越強。

1.2.6 Annexin V-PI雙染法檢測食管癌細胞凋亡率: 本研究以實驗步驟1.2.5得出的VER逆轉ADM化療耐藥能力差異最為顯著的一對食管癌細胞為對象進行細胞凋亡檢測，每個細胞分成4組，即正常組(NC)、單用VER組(VER)、單用化療藥物組、VER聯合化療藥物組，考慮化療藥物毒性及后續實驗，化療藥物劑量選擇該細胞株IC501值1/5倍濃度，VER劑量4.91 μg/mL。

采用10%FBS的RMPI-1640在6孔板中培養細胞24 h至匯合度為70%左右，胰酶消化后用10%FBS的培養基終止胰酶作用, 1 000 r/min、4 ℃離心5 min, 并用預冷的PBS清洗2次，將細胞重懸于100 μL binding buffer, 再加入 2 μL的 Annexin V-FITC, 混勻，避光于冰上放置15 min, 加入400 μL PBS，每個樣品在臨上流式細胞儀前再加1 μL的PI溶液，吹勻后迅速檢測食管癌細胞凋亡率。

1.3 統計學分析

連續型變量以均數±標準差進行統計學描述，數據分析采用Excel (Microsoft, Redmond, WA) 或者 Prism (Prism 4.0, GraphPad Inc, La Jolla, CA, USA)進行單因素方差分析或者Mann-Whitney U檢驗，實驗均重復3次以上,P<0.05為差異有統計學意義

2 結 果

2.1 4種食管癌細胞系對紫杉醇、順鉑、5-氟尿 嘧啶耐藥性判定的分析

作者通過CCK-8分析法對4種食管癌細胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)對3種化療藥物(紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶)IC50實驗結果顯示，紫杉醇在KYSE-450和EC9706的IC50值明顯大于EC109和TE-1, 順鉑在TE-1細胞中IC50值明顯小于其他3種細胞, 5-氟尿嘧啶在EC109中IC50值明顯高于在其他3種細胞。KYSE-450和EC9706對紫杉醇耐藥性大于EC109和TE-1; BEL-EC9706、EC109、KYSE-450對順鉑耐藥性大于TE-1, EC109對5-氟尿嘧啶耐藥性顯著大于其他3種細胞。見表1、2。

表1 3種化療藥物對4種食管癌細胞系IC501值

表2 3種化療藥物對4食管癌細胞系IC50相對值

2.2 3種化療藥物分別聯合維拉帕米逆轉食管 癌細胞化療耐藥特性的判定

為了研究維拉帕米逆轉食管癌耐藥性的機制，作者需要選擇維拉帕米逆轉效果最好的食管癌細胞系及對應的化療藥物作為研究對象。因此，作者用固定濃度的維拉帕米(4.91 μg/mL)聯合化療藥物處理每種細胞, CCK8法檢測固定濃度的維拉帕米聯合化療藥物針對4種食管癌細胞系(EC109, BEL-EC9706, KYSE-450和TE-1) IC50值。研究發現，加用維拉帕米后, 4種食管癌細胞系(EC109, BEL-EC9706, KYSE-450和TE-1)針對紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶的IC50值均不同程度下降，提示維拉帕米均不同程度提高了上述3種化療藥物的敏感性。見表3。

表3 維拉帕米(4.91 μg/mL)聯合化療藥物對4食管癌細胞系IC502值

2.3 維拉帕米逆轉化療藥物耐藥能力判定

維拉帕米逆轉化療藥物耐藥效率指數，以IC501/IC502結果判定，值越大說明能力越強。其中，順鉑組未加入維拉帕米前, EC109, EC9706, KYSE-450與TE-1相比，均存在不同程度耐藥性; 加入維拉帕米后，針對BEL-EC9706 IC50值變化倍數較大(15.2倍)，提示逆轉敏感; 針對EC109IC50值變化倍數較小(1.6倍)，提示逆轉耐受。結果表明，維拉帕米逆轉EC9706的順鉑效率指數最高(15.2倍)，與EC109細胞相比有顯著差異(1.6倍)。提示BEL-EC9706(順鉑)對維拉帕米的逆轉敏感，而EC109(順鉑)對維拉帕米的逆轉耐受。見表4。

表4 維拉帕米逆轉化療藥物耐藥效率指數(IC501/IC502)

2.4 Annexin V-PI雙染法檢測食管癌細胞凋亡

本研究以實驗2.3得出的VER逆轉順鉑化療耐藥能力差異最為顯著的一對食管癌細胞(EC109和EC9706)為研究對象檢測食管癌細胞凋亡，如圖1所示，針對EC109細胞，NC組、VER組、DDP組、VER+DDP組細胞凋亡分別為2.1%、4%、15.4%、18.6%; 針對EC9706細胞, NC組、VER組、DDP組、VER+DDP組細胞凋亡分別為0.1%、3.1%、12.5%、22.1%。如圖2所示，與NC組相比, VER組細胞凋亡率無顯著差異(P>0.05); 針對EC109細胞, DDP組與VER+DDP組相比，細胞凋亡率有顯著差異(P<0.05), 針對EC9706細胞, DDP組與VER+DDP組相比，細胞凋亡率有顯著差異(P<0.01)。這說明，維拉帕米有可能通過促進細胞調亡途徑提高其逆轉化療耐受的能力，從而增強化療藥物敏感性。

圖1 AnnexinV-PI雙染法檢測食管癌細胞凋亡

圖2 兩種食管癌細胞凋亡率測定

3 討 論

食管癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一[7], 中國則是世界上食管癌發病率和死亡率最高的國家，每年新發病例約25萬，占全世界新發病例的50%以上[8]。目前化療是晚期食管癌最主要的治療手段之一，但化療過程中出現的多藥耐藥(MDR)現象嚴重影響了臨床的化療效果。作者通過CCK-8分析法對4種食管癌細胞系(EC109、EC9706、KYSE-450、TE-1)對3種化療藥物(紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶)IC50實驗結果顯示，紫杉醇在KYSE-450和EC9706的IC50值明顯大于EC109和TE-1, 順鉑在TE-1細胞中IC50值明顯小于其他3種細胞, 5-氟尿嘧啶在EC109中IC50值明顯高于在其他3種細胞。KYSE-450和EC9706對紫杉醇耐藥性大于EC109和TE-1; EC9706、EC109、KYSE-450對順鉑耐藥性大于TE-1, EC109對5-氟尿嘧啶耐藥性顯著大于其他3種細胞。這說明，食管癌細胞對不同化療藥物存在不同程度的耐藥性。

維拉帕米靜脈應用導致的心血管毒性限制了其作為一種逆轉化療耐藥的藥物的臨床應用，我課題組通過動脈介入灌注維拉帕米聯合化療藥物，明顯提高了臨床療效，且未見明顯心血管毒副反應，但仍有部分患者療效欠佳[9-13], 這說明，不同患者對維拉帕米的治療反應是不同的，這可能與維拉帕米逆轉不同食管癌細胞的能力有明顯差異相關。本研究以4種食管癌細胞株為研究對象，開展維拉帕米提高食管癌細胞的化療敏感性的研究。研究[14-16]發現，加用維拉帕米后, 4種食管癌細胞系(EC109, EC9706, KYSE-450和TE-1)針對紫杉醇、順鉑、5-氟尿嘧啶的IC50值均不同程度下降，提示維拉帕米均不同程度提高了上述3種化療藥物的敏感性。其中，順鉑組未加入維拉帕米前, EC109, EC9706, KYSE-450與TE-1相比，均存在不同程度耐藥性，加入維拉帕米后，針對BEL-EC9706 IC50值變化倍數較大(15.2倍)，提示逆轉敏感; 針對EC109 IC50值變化倍數較小(1.6倍)，提示逆轉耐受。結果表明，維拉帕米逆轉EC9706的順鉑效率指數最高(15.2倍)，與EC109細胞相比有顯著性差異(1.6倍)。提示BEL-EC9706(順鉑)對維拉帕米的逆轉敏感，而EC109(順鉑)對維拉帕米的逆轉耐受。

為進一步探討維拉帕米提高化療藥物敏感性可能機制，作者以VER逆轉順鉑化療耐藥能力差異最為顯著的一對食管癌細胞(EC109和EC9706)為研究對象檢測食管癌細胞凋亡，針對EC109細胞, NC組、VER組、DDP組、VER+DDP組細胞凋亡分別為2.1%、4%、15.4%、18.6%; 針對EC9706細胞, NC組、VER組、DDP組、VER+DDP組細胞凋亡分別為0.1%、3.1%、12.5%、22.1%。針對EC109細胞, DDP組與VER+DDP組相比，細胞凋亡率有顯著性差異(P<0.05), 針對EC9706細胞, DDP組與VER+DDP組相比，細胞凋亡率有顯著性差異(P<0.01), 這說明，維拉帕米有可能通過促進細胞調亡途徑提高其逆轉化療耐受的能力，從而增強化療藥物敏感性。

總之，維拉帕米逆轉EC9706的順鉑效率指數最高(15.2倍)，與EC109細胞相比有顯著性差異(1.6倍)。提示EC9706(DDP)對維拉帕米的逆轉敏感，而EC109(DDP)對維拉帕米的逆轉耐受。維拉帕米有可能通過促進細胞調亡途徑提高其逆轉化療耐受的能力，從而增強化療藥物敏感性。

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Experimentalstudyofverapamilmediatedapoptosisofesophagealcancercellsandmulti-drugresistance

WENGChengtao,ZHANGTengyue,LIUYabei,FANGaofei,WUYang,FANPingsheng

(DepartmentofOncology,AnhuiTumorHospital,Hefei,Anhui, 230031)

ObjectiveTo investigate the effect of verapamil on chemosensitivity and apoptosis of esophageal cancer cells.MethodsThe IC50values(IC501) of three kinds of chemotherapy drugs: paclitaxel, cisplatin, and 5-fluorouracil were detected by CCK-8 method in 4 kinds of esophageal cancer cell lines (EC109, EC9706, KYSE-450, TE-1). Each cell was processed by verapamil (4.91 μg/mL) combined with the chemotherapy treatment above, IC50(IC502) value was detected by CCK8 assay combined with chemotherapy for the verapamil of the 4 esophageal carcinoma cell lines (EC109, EC9706, KYSE-450 and TE-1). A pair of esophageal cancer cells with the most significant reversal of the resistance to chemotherapy by VER detected by the previous experiments were included as research objects, and Annexin V-PI double staining method was used to detect the apoptosis of esophageal cancer cells.ResultsThe IC50values of paclitaxel in KYSE-450 and EC9706 cell lines were significantly higher than that in EC109 and TE-1. The IC50values of cisplatin in TE-1 cells were significantly less than those in the other three cells, while the IC50values of 5-fluorouracil in EC109 were significantly higher than that in other three cell lines. After adding verapamil, the IC50values of paclitaxel, cisplatin and 5-fluorouracil in four esophageal cancer cell lines (EC109, EC9706, KYSE-450 and TE-1) all decreased to different degrees, and the above three kinds of chemotherapeutic drugs had increased their sensitivity to varying degrees. Among them, the cisplatin group before adding verapamil had different degrees of resistance compared with EC109, EC9706, KYSE-450, TE-1. After joining verapamil, IC50value change for the EC9706 multiplied for 15.2 times, suggesting that the reversal was sensitive; IC50value change for EC109 was 1.6 times smaller, suggesting that the reversal was tolerant.ConclusionVerapamil reversal of EC9706 adriamycin has highest efficiency index (15.2 times), there was significant difference compared with the EC109 cells (1.6 times). Tipthe EC9706 (DDP) sensitivity to the reversal of verapamil, and EC109 (DDP) reverse resistance of verapamil. Verapamil may enhance the ability to reverse chemotherapy tolerance by promoting cell apoptosis, thereby enhancing the sensitivity of chemotherapeutic drugs.

verapamil; esophageal cancer; drug resistance; reversal ability, apoptosis

2017-07-20

國家自然基金(81172364, 81201576); 安徽省自然科學基金(1408085MH211);安徽省衛生廳重點科研項目(2010A006)

范平生

R 735.1

A

1672-2353(2017)24-001-05

10.7619/jcmp.201724001