急性缺血性卒中合并頸動(dòng)脈斑塊患者神經(jīng)功能損傷與血漿氧化低密度脂蛋白水平相關(guān)性研究

蘇兆萍，楊寓玲，劉長(zhǎng)城，趙晶，孟維靜，楊光，王素珍

卒中已成為全球致死和致殘的首要病因。目前，全世界大約有3300萬(wàn)卒中患者，其中很大比例患者具有中重度神經(jīng)功能損傷，加重了全球卒中相關(guān)的醫(yī)療負(fù)擔(dān)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。研究證實(shí)，頸動(dòng)脈斑塊在動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）基礎(chǔ)上發(fā)生潰瘍、破裂進(jìn)而激活血小板使血栓形成，最終導(dǎo)致血管閉塞是急性缺血性卒中（acute ischemic stroke，AIS）發(fā)生的主要機(jī)制之一[2-3]。而氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）可誘導(dǎo)炎癥因子的釋放、血管內(nèi)皮功能障礙和平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞的移動(dòng)，是AS的啟動(dòng)和發(fā)展的關(guān)鍵[4-6]。本研究推測(cè)：ox-LDL可能參與了AIS后神經(jīng)功能損傷的發(fā)展過(guò)程。因此，本研究通過(guò)分析存在頸動(dòng)脈斑塊的AIS患者早期美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院卒中量表（National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS）評(píng)分與血漿ox-LDL的關(guān)系，探討AIS后神經(jīng)功能損傷與ox-LDL的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 該研究入選人群來(lái)自急性缺血性卒中患者氧化應(yīng)激水平的臨床觀察研究（Study on Oxidative Stress in Patients with Acute Ischemic Stroke，SOS-Stroke）[7]。該研究納入了來(lái)自全國(guó)43個(gè)醫(yī)療機(jī)構(gòu)的4164例AIS患者。本研究已通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院和北京協(xié)和醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并取得所有參與者或授權(quán)親屬的知情同意。入選標(biāo)準(zhǔn)：①年齡≥18歲；②AIS均被神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師通過(guò)頭部計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）或磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）診斷；③AIS發(fā)病到確診＜7 d；④均簽署知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①通過(guò)頭部CT或MRI證實(shí)患者有出血性、其他病理性（血管畸形、腫瘤、膿腫、多發(fā)硬化）或非缺血性腦血管疾病；②短暫性腦缺血發(fā)作（transient ischemic attack，TIA）；③因血管成形或其他手術(shù)操作導(dǎo)致的醫(yī)源性卒中。

1.2 NIHSS評(píng)分評(píng)估神經(jīng)功能損傷 所有患者均在入院24 h內(nèi)接受NIHSS評(píng)分。NIHSS評(píng)分均由兩名臨床經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師參照NIHSS量表進(jìn)行評(píng)估，取平均值作為最終評(píng)分。

1.3 血液樣本的采集與ox-LDL測(cè)定 經(jīng)肘靜脈抽取晨起空腹血5 ml，置于防氧化劑及抗凝的真空管中。搖勻后，2000 r/min離心5 min后析出血漿；微量移液器移取血漿置于聚丙烯試管中，-80℃保存。用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）測(cè)定血漿ox-LDL水平。ox-LDL試劑盒購(gòu)自美國(guó)RapidBio Lab公司，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 頸動(dòng)脈斑塊性質(zhì)的判定 所有患者均在入院24 h內(nèi)行頸動(dòng)脈超聲檢查。①頸動(dòng)脈斑塊判斷標(biāo)準(zhǔn)：頸動(dòng)脈內(nèi)-中膜厚度（intima-media thickness，IMT）是指在血管橫截面上，從斑塊纖維帽管腔面至血管外膜內(nèi)緣的垂直距離。IMT≥1.5 mm為斑塊形成。②斑塊穩(wěn)定性判斷標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)斑塊的聲學(xué)特性，將其分為低回聲、等回聲及強(qiáng)回聲斑塊。兩種回聲斑塊同時(shí)存在為混合性斑塊。斑塊潰瘍指斑塊表面不光滑，至少有長(zhǎng)2 mm和深2 mm的凹陷，且斑塊有明顯的基底。將表面光滑、強(qiáng)回聲斑塊定義為穩(wěn)定性斑塊，低回聲、等回聲、混合回聲和潰瘍斑塊定義為不穩(wěn)定性斑塊[8]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料使用或中位數(shù)（四分位數(shù)）表示。計(jì)數(shù)資料使用頻數(shù)（百分比）表示。計(jì)量資料符合正態(tài)分布的使用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理；非正態(tài)分布資料使用Kruskal-Wallis H或Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；分類變量使用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法進(jìn)行比較。多元線性回歸分析用于評(píng)估ox-LDL與AIS患者神經(jīng)功能損傷的相關(guān)性。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 AIS患者的基線特征 本研究在4164例注冊(cè)登記的SOS-Stroke研究中，入選了2421例AIS合并頸動(dòng)脈斑塊的患者，男1607例，女814例，平均年齡（65.17±11.39）歲，ox-LDL平均水平為（56.55±20.86）μg/dl，平均NIHSS評(píng)分為4（2～8）分。NIHSS＞5分組患者的血漿ox-LDL水平顯著高于NIHSS≤5分組患者的血漿ox-LDL水平（P＜0.0001）。而且，與NIHSS≤5分組比較，NIHSS＞5分組的患者年齡更大（P=0.0002），且更多為女性（P=0.0004）。然而，兩組患者頸動(dòng)脈斑塊的穩(wěn)定性與不穩(wěn)定性未見(jiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表1）。

2.2 NIHSS評(píng)分與血漿ox-LDL水平之間的多因素分析 在多元線性回歸分析模型中，AIS患者血漿ox-LDL水平對(duì)NIHSS評(píng)分具有顯著的影響。校正年齡、性別、高血壓、糖尿病等因素后，血漿ox-LDL水平對(duì)NIHSS評(píng)分仍有顯著影響，且ox-LDL每升高10個(gè)單位，NIHSS評(píng)分增加0.23分（P＜0.0001）（表2）。

2.3 因素分層對(duì)NIHSS評(píng)分與血漿ox-LDL水平相關(guān)性的影響 在基于年齡、性別及斑塊穩(wěn)定性分層的多元線性回歸分析模型中，校正了體質(zhì)指數(shù)、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白及甘油三酯等混雜因素后，男性與女性、是否超過(guò)65歲以及頸動(dòng)脈斑塊是否穩(wěn)定未對(duì)NIHSS評(píng)分與血漿ox-LDL水平相關(guān)性產(chǎn)生影響（表3）。

表1 輕度（NIHSS≤5分）與中重度（NIHSS＞5分）AIS患者基線資料比較

3 討論

ox-LDL作為AS的始動(dòng)因素，已成為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，并且增加了急性心肌梗死患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)[9-10]。腦血管粥樣硬化性病變與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化具有相似的病理生理機(jī)制，而且有研究證實(shí)，AIS患者的血漿ox-LDL水平顯著高于健康人群[11]。NIHSS評(píng)分操作簡(jiǎn)單、可重復(fù)性強(qiáng)，是評(píng)估卒中患者神經(jīng)功能損傷的簡(jiǎn)捷、有效的方法[12]。但是AIS患者神經(jīng)功能損傷與血漿ox-LDL水平相關(guān)性研究尚少。本研究的結(jié)果顯示：AIS患者NIHSS評(píng)分與ox-LDL水平呈正相關(guān)性。

表2 AIS患者NIHSS評(píng)分與每增加10個(gè)單位ox-LDL水平之間的多因素分析

表3 不同因素分層的NIHSS評(píng)分與每增加10個(gè)單位ox-LDL水平之間的多因素線性回歸分析

本研究證實(shí)而且進(jìn)一步拓展了以前的相關(guān)研究。Ryglewicz等[13]研究證明頸動(dòng)脈狹窄導(dǎo)致卒中患者血液中低密度脂蛋白呈明顯氧化狀態(tài)。Uno等[14]評(píng)估了ox-LDL與急性卒中缺血損傷的關(guān)系并證實(shí)持續(xù)升高的ox-LDL水平與AIS早期腦缺血損傷面積增大具有相關(guān)性。

然而，NIHSS評(píng)分與血漿ox-LDL水平之間正相關(guān)性的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。ox-LDL在AS的進(jìn)展和破裂過(guò)程中起到了至關(guān)重要的作用：①ox-LDL具有細(xì)胞毒性，可致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[15]；②ox-LDL促進(jìn)單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞向血管內(nèi)膜下遷移，但抑制巨噬細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，從而促進(jìn)了脂質(zhì)的沉積[16]；③ox-LDL可刺激機(jī)體炎癥因子釋放，促進(jìn)粥樣斑塊的炎癥反應(yīng)和不穩(wěn)定性，最終增加了AS所導(dǎo)致的AIS發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。此外，ox-LDL不僅反映了機(jī)體的氧化狀態(tài)，而且可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生氧自由基，對(duì)維持機(jī)體氧化應(yīng)激的狀態(tài)具有重要的作用。而氧化應(yīng)激可加重AIS的神經(jīng)功能損傷。另外，全身或局部氧化應(yīng)激進(jìn)一步促進(jìn)低密度脂蛋白向ox-LDL轉(zhuǎn)化[17]。上述可能解釋AIS患者NIHSS評(píng)分與持續(xù)增高的ox-LDL水平之間的正相關(guān)性。

頸動(dòng)脈斑塊的不穩(wěn)定性與AIS的發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)。相關(guān)研究顯示，粥樣硬化斑塊損傷所致的血栓造成了高達(dá)80%的急性心腦血管病事件[8]。另有研究顯示，年齡和血漿ox-LDL水平是頸動(dòng)脈斑塊形成的危險(xiǎn)因素，而且后者與斑塊的不穩(wěn)定性密切相關(guān)[18]。盡管年齡與AS形成具有正相關(guān)性，但是隨著年齡增加，AS逐漸出現(xiàn)鈣化，斑塊的炎癥反應(yīng)也逐漸減弱。Redgrave等[19]研究也發(fā)現(xiàn)，年齡與AS的不穩(wěn)定性無(wú)顯著相關(guān)性。

Cipollone等[20]研究發(fā)現(xiàn)，ox-LDL可激活內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶的活性，使得基質(zhì)金屬蛋白酶增多。而基質(zhì)金屬蛋白酶-2和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMSE-9）能特異性地黏附和降解細(xì)胞外基質(zhì)，從而導(dǎo)致纖維帽變薄，增加斑塊的不穩(wěn)定性。另外，ox-LDL可促進(jìn)巨噬或單核細(xì)胞分泌并釋放腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）等炎癥因子，一方面促使炎癥細(xì)胞聚集，增加斑塊的炎癥反應(yīng)；另一方面加重內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙進(jìn)而壞死，使纖維帽進(jìn)一步變薄，促進(jìn)斑塊破裂[21-22]。本研究根據(jù)頸動(dòng)脈斑塊的性質(zhì)進(jìn)行分層，發(fā)現(xiàn)與穩(wěn)定斑塊AIS患者比較，不穩(wěn)定斑塊患者血漿ox-LDL水平顯著增高。然而，不穩(wěn)定斑塊僅是AIS發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。因此本研究中頸動(dòng)脈斑塊穩(wěn)定與否對(duì)NIHSS評(píng)分與血漿ox-LDL水平相關(guān)性未產(chǎn)生影響。

本研究結(jié)果表明升高的血漿ox-LDL水平可反映AIS患者神經(jīng)功能損傷的嚴(yán)重程度。但是本研究也存在一定的局限性：①作為橫斷面研究，未闡述AIS后ox-LDL水平變化與NIHSS評(píng)分之間的關(guān)系；②僅將頸動(dòng)脈斑塊易損性作為分層因素，不同的AIS亞型或許對(duì)ox-LDL水平與NIHSS評(píng)分的相關(guān)性產(chǎn)生影響。由于ox-LDL對(duì)AS的發(fā)生、發(fā)展和破裂以及影響氧化應(yīng)激方面具有重要作用，進(jìn)一步的研究應(yīng)該致力于血漿ox-LDL水平變化與不同卒中亞型AIS預(yù)后的關(guān)系，以及AIS早期抗氧化治療。

1 Lozano R，Naghavi M，F(xiàn)oreman K，et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010：a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010[J]. Lancet，2012，380：2095-2128.

2 Katagiri H，Yamada T，Oka Y. Adiposity and cardiovascular disorders：disturbance of the regulatory system consisting of humoral and neuronal signals[J]. Circ Res，2007，101：27-39.

3 Cherubini A，Ruggiero C，Polidori MC，et al.Potential markers of oxidative stress in stroke[J]. Free Radic Biol Med，2005，39：841-852.

4 Kugiyama K，Kerns SA，Morrisett JD，et al.Impairment of endothelium-dependent arterial relaxation by lysolecithin in modified low-density lipoproteins[J]. Nature，1990，344：160-162.

5 Stiko-Rahm A，Hultg?rdh-Nilsson A，Regnstr?m J，et al. Native and oxidized LDL enhances production of PDGFAA and the surface expression of PDGF receptors in cultured human smooth muscle cells[J].Arterioscler Thromb，1992，12：1099-1109.

6 Yui S，Sasaki T，Miyazaki A，et al. Induction of murine macrophage growth by modified LDLs[J].Arterioscler Thromb，1993，13：331-337.

7 Yue W，Wang A，Liang H，et al. Association between carotid intima-media thickness and cognitive impairment in a Chinese stroke population：A crosssectional study[J]. Sci Rep，2016，6：19 556.

8 Vir mani R，Ladich ER，Burke AP，et al.Histopathology of carotid atherosclerotic disease[J].Neurosurgery，2006，59：S219-227; discussion S3-13.

9 Chen KC，Liao YC，Wang JY，et al. Oxidized lowdensity lipoprotein is a common risk factor for cardiovascular diseases and gastroenterological cancers via epigenomical regulation of microRNA-210[J]. Oncotarget，2015，6：24 105-24 118.

10 Ehara S，Ueda M，Naruko T，et al. Elevated levels of oxidized low density lipoprotein show a positive relationship with the severity of acute coronary syndromes[J]. Circulation，2001，103：1955-1960.

11 Vibo R，K?rv J，Roose M，et al. Acute phase proteins and oxidised low-density lipoprotein in association with ischemic stroke subtype，severity and outcome[J].Free Radic Res，2007，41：282-287.

12 Yao M，Herve D，Allili N，et al. NIHSS scores in ischemic small vessel disease：a study in CADASIL[J].Cerebrovasc Dis，2012，34：419-423.

13 Ryglewicz D，Rodo M，Roszczynko M，et al.Dynamics of LDL oxidation in ischemic stroke patients[J]. Acta Neurol Scand，2002，105：185-188.

14 Uno M，Harada M，Takimoto O，et al. Elevation of plasma oxidized LDL in acute stroke patients is associated with ischemic lesions depicted by DWI and predictive of infarct enlargement[J]. Neurol Res，2005，27：94-102.

15 Jialal I. Evolving lipoprotein risk factors：lipoprotein(a) and oxidized low-density lipoprotein[J].Clin Chem，1998，44：1827-1832.

16 Steinberg D. Low density lipoprotein oxidation and its pathobiological significance[J]. J Biol Chem，1997，272：20 963-20 966.

17 Guldiken B，Guldiken S，Turgut B，et al. The roles of oxidized low-density lipoprotein and interleukin-6 levels in acute atherothrombotic and lacunar ischemic stroke[J]. Angiology，2008，59：224-229.

18 Fang R，Zhang N，Wang C，et al. Relations between plasma ox-LDL and carotid plaque among Chinese Han ethnic group[J]. Neurol Res，2011，33：460-466.

19 Redgrave JN，Lovett JK，Rothwell PM. Histological features of symptomatic carotid plaques in relation to age and smoking：the oxford plaque study[J]. Stroke，2010，41：2288-2294.

20 Cipollone F，Iezzi A，F(xiàn)azia M，et al. The receptor RAGE as a progression factor amplifying arachidonatedependent inflammatory and proteolytic response in human atherosclerotic plaques：role of glycemic control[J]. Circulation，2003，108：1070-1077.

21 Rajavashisth TB，Liao JK，Galis ZS，et al.Inflammatory cytokines and oxidized low density lipoproteins increase endothelial cell expression of membrane type 1-matrix metalloproteinase[J]. J Biol Chem，1999，274：11 924-11 929.

22 Dwivedi A，Anggard EE，Carrier MJ. Oxidized LDL-mediated monocyte adhesion to endothelial cells does not involve NF kappaB[J]. Biochem Biophys Res Commun，2001，284：239-244.