結(jié)核菌檢測(cè)技術(shù)聯(lián)合運(yùn)用于結(jié)核病診斷及耐藥結(jié)核病診斷的研究

戚超群 尹作梅

（1臨沂市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 山東 臨沂 276034）

（2臨沂市中心血站 山東 臨沂 276034）

結(jié)核病作為一種傳染病，它的流行要具備三個(gè)條件：傳染源，傳播途徑，易感人群。我國(guó)早在1982年就已經(jīng)實(shí)施出生的嬰幼兒接種卡介苗來(lái)保護(hù)結(jié)核菌易感人群，然而，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率，艾滋病等的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重降低了人群對(duì)結(jié)核菌的抵抗力；結(jié)核病的傳播途徑為呼吸道飛沫傳播，隨著社會(huì)的發(fā)展，交通的便捷，人流物流都在加快，傳播途徑也不容易阻斷；因此，控制傳染源已經(jīng)完全成為控制結(jié)核病的有效手段。2016年，全國(guó)有95萬(wàn)人患結(jié)核病，死亡1600人之多[1]；耐藥結(jié)核病，尤其是耐多藥結(jié)核病（MDR-TB）更是結(jié)核病控制的重大威脅。本研究采用多技術(shù)聯(lián)合的方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，分析方法的敏感性、特異性及檢出率，以期用于結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病的快速診斷。

1.材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

722例臨床診斷結(jié)核病（包括20例NTM感染病例）患者的標(biāo)本采自2015年12月-2017年1月，臨沂市人民醫(yī)院及蘭山區(qū)第三人民醫(yī)院住院及門(mén)診病人。包括痰標(biāo)本688份，支氣管肺泡灌洗液5份，肺外標(biāo)本29份（包括尿液、胸腹水、胃液、膿液、腦脊液等）。各種標(biāo)本的留取方法參見(jiàn)《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[2]。

1.2 患者的診斷

通過(guò)回顧查閱患者的病案資料，722例（包括20例NTM感染病例）都符合2002年衛(wèi)生部制定的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)《臨床診療指南結(jié)核病分冊(cè)》，臨床表現(xiàn)有長(zhǎng)期低熱、盜汗、反復(fù)咳嗽、咳痰、消瘦、食欲不振、精神乏力等，經(jīng)抗結(jié)核治療有效。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本前處理 前處理采用堿處理法，標(biāo)本轉(zhuǎn)移至離心管，根據(jù)標(biāo)本性狀加入1～2倍量NALC-NAOH，震蕩至均勻的狀態(tài)，然后靜置消化15分鐘，用GENEXPERT TB/RIF的專(zhuān)用吸管吸取2ml加入CARTRIDGE反應(yīng)盒內(nèi)，盡快放入GENEXPERT TB/RIF反應(yīng)儀啟動(dòng)反應(yīng)，剩余的離心管里加入已經(jīng)滅菌的PH 6.8的PBS緩沖液至45ml處，顛倒混勻，放入低溫離心機(jī)（8℃）以3000轉(zhuǎn)/分，離心15分鐘，取出，棄去上清液，于沉淀中加入1ml左右PBS液，震蕩混勻，靜置15分鐘，期間給羅氏培養(yǎng)管，玻片編號(hào)，然后輕輕打開(kāi)標(biāo)本處理管，吸取約0.3ml接種3支羅氏培養(yǎng)管，其中1支放29℃培養(yǎng)，2支放36℃培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株接種傳統(tǒng)比例法藥敏培養(yǎng)基。然后吸取約0.05ml涂抹于載玻片，制成1×2cm面積的薄膜，進(jìn)行熒光染色后鏡檢；涂片或者GENEXPERT TB/RIF任一陽(yáng)性標(biāo)本吸取0.005ml加入線性探針DNA提取管，用于GenoType MTBDRplu的實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增程序用標(biāo)本擴(kuò)增程序。

1.3.2 結(jié)核菌檢測(cè) 痰涂片熒光染色，羅氏培養(yǎng)法，傳統(tǒng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)、XPERT MTB/RIF、GenoTypeMTBDRplu檢測(cè)步驟皆參照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判定與報(bào)告 若涂片陽(yáng)性，GENEXPERT TB/RIF陰性，多為NTM感染，報(bào)抗酸桿菌陽(yáng)性，備注：可能為NTM；若涂片陽(yáng)性，GENEXPERT TB/RIF陽(yáng)性，報(bào)MTB陽(yáng)性，RIF resistance檢出，報(bào)利福平耐藥（R），RIF resistance未檢出，則報(bào)利福平敏感（S），RIF resistance不確定，則報(bào)利福平耐藥結(jié)果無(wú)法判讀；若涂片陰性，GENEXPERT TB/RIF陽(yáng)性，報(bào)告MTB陽(yáng)性，報(bào)告方式同上；GenoType MTBDRplu實(shí)驗(yàn)中，若結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群鑒定條帶(TUB帶)陰性，表示所試細(xì)菌不屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，不能用本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)判讀藥敏結(jié)果，報(bào)告NTM，無(wú)藥敏結(jié)果；若TUB陽(yáng)性，則按實(shí)驗(yàn)要求分別判斷對(duì)利福平和異煙肼的耐藥情況并給出報(bào)告。

1.3.4 耐多藥結(jié)核病的快速診斷 若GenoTypeMTBDRplu實(shí)驗(yàn)異煙肼耐藥，GENEXPERT TB/RIF或GenoType MTBDRplu任一實(shí)驗(yàn)利福平耐藥，則判為MDR患者。

2.結(jié)果

見(jiàn)表1、表2、表3。

表1 GENEXPERT TB/RIF與傳統(tǒng)改良羅氏培養(yǎng)法結(jié)果比較

722 份患者標(biāo)本，286份羅氏法培養(yǎng)陽(yáng)性，后經(jīng)比例法藥敏實(shí)驗(yàn)鑒定，其中結(jié)核分枝桿菌265例，牛分枝桿菌1例，另外還有20例為NTM，陽(yáng)性率為39.6%，272份快速法診斷陽(yáng)性，陽(yáng)性率為37.7%，以臨床診斷為金標(biāo)準(zhǔn)，二者陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.572，P＞0.05）。以羅氏培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，快速法的敏感度 為95.1%，特異度為99.8%，符合率為95%。在檢測(cè)時(shí)間方面快速法當(dāng)日即可報(bào)告結(jié)果，而培養(yǎng)需要3～8周才能報(bào)告結(jié)果。

表2 GENEXPERT TB/RIF與比例法藥敏檢測(cè)結(jié)核菌（除去NTM）利福平耐藥比較

表3 GENOTYPE MTBDRPLUS 檢測(cè)結(jié)核菌（除去NTM）異煙肼、利福平耐藥與比例法比較

以比例法藥敏實(shí)驗(yàn)為金標(biāo)準(zhǔn)，GENEXPERT TB/RIF 檢出對(duì)利福平耐藥的敏感度為78.8%，特異度為99.6%；GenoType MTBDRplu法檢出對(duì)利福平的敏感度為75.8%，特異度為99.5%，對(duì)異煙肼的敏感度為80%，特異度99.1%。MDR檢出率為73.1%，48h內(nèi)即可對(duì)結(jié)核病及耐多藥結(jié)核病作出實(shí)驗(yàn)室診斷報(bào)告。相比比例法藥敏要等7～8周，聯(lián)合檢測(cè)技術(shù)顯示了較大的時(shí)間優(yōu)勢(shì)。

3.討論

WHO2014年版《耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南伙伴手冊(cè)》對(duì)藥敏試驗(yàn)有所更新，指出藥敏試驗(yàn)包括了表型藥敏試驗(yàn)（即傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)）和基因型藥敏試驗(yàn)。筆者認(rèn)真思考和總結(jié)了表型藥敏試驗(yàn)和基因型藥敏試驗(yàn)的區(qū)別，表型藥敏試驗(yàn)對(duì)耐藥的定義為：耐藥百分比大于1%，則認(rèn)為受試菌對(duì)該抗結(jié)核藥耐藥[3]，換句話說(shuō)，100條結(jié)核菌里有1條以上耐藥，即對(duì)該藥耐藥，我們做藥敏試驗(yàn)?zāi)ゾ鷷r(shí)取的菌量較多，取到那1%的幾率要大，而我們的目的菌就是這1%。在基因型藥敏試驗(yàn)中，檢測(cè)的基因突變是對(duì)所取標(biāo)本中所含有的多數(shù)菌的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，而那1%所占比例太小，以至于不能檢出，或者就干脆沒(méi)有取到那1%，它所代表的是較多數(shù)細(xì)菌的基因突變情況。所以，本實(shí)驗(yàn)也印證了表型藥敏試驗(yàn)對(duì)MDR的檢出率比基因型藥敏試驗(yàn)要高的道理。李強(qiáng)等[4]的研究也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。

本研究采用的參照體系羅氏培養(yǎng)法分枝桿菌培養(yǎng)、及比例法藥敏試驗(yàn)，在快速診斷方面采用離心濃縮涂片熒光染色＋XPERT MTB/RIF+GenoType MTBDRplu的聯(lián)合檢測(cè)，通過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行鑒別，顯著提高了結(jié)核病和耐藥結(jié)核病人的檢出率，解決了涂片熒光染色只能檢出抗酸桿菌，無(wú)法區(qū)分結(jié)核或非結(jié)核分枝桿菌的問(wèn)題，XPERT MTB/RIF的檢測(cè)靶標(biāo)為DNA，能檢出涂片陰性的MTB，把NTM給排除掉，而且能夠比較精確地反映菌量的多少，與GenoType MTBDRplu結(jié)合檢測(cè)是否對(duì)利福平、異煙肼耐藥，各種方法之間優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，互相印證，有效避免了假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)，以及標(biāo)本中非結(jié)核分枝桿菌對(duì)結(jié)果的干擾，滿足臨床對(duì)結(jié)核病和耐多藥結(jié)核病快速診斷的需求。但相對(duì)于傳統(tǒng)藥敏方法，線性探針GenoType MTBDRplu試劑盒成本較高，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及技術(shù)人員要求也高，很多基層單位無(wú)力承擔(dān)建設(shè)基因?qū)嶒?yàn)室的費(fèi)用，廣泛推廣難度大，是它的不足之處。

[1]衛(wèi)生計(jì)生部結(jié)核病控制中心官網(wǎng).

[2]趙雁林,逄宇.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程，人民衛(wèi)生出版社,2015年6月,P:5-10.

[3]趙雁林，逄宇.結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程，人民衛(wèi)生出版社,2015年6月,P:62.

[4]Li Qiang,Dong Haiyan,Pang Yu,etal,Multicenter Evaluation of the Molecular Line Probe Assay for Multidrug Resistant Mycobacterium Tuberculosis Detection in China[J].Biomed Environ,2015,28(6):464-467.