Vero細胞微載體懸浮培養(yǎng)生產工藝研究

王景慶 游松 張微

（沈陽藥科大學 遼寧 沈陽 110016）

動物細胞的體外培養(yǎng)已經(jīng)廣泛應用于藥品特別是疫苗的生產中，通過生物反應器對Vero細胞和病毒進行大規(guī)模、高密度培養(yǎng)，并通過此方式進一步生產狂犬、乙腦等疫苗在國內已經(jīng)為主流技術[1]。Vero細胞是一種典型的貼壁依賴性動物細胞，其生長、擴增繁殖需要有足夠大的表面積，球狀微載體懸浮培養(yǎng)這一技術平臺很好的解決了以上的限制因素。因為很多種類的病毒（如狂犬病毒等）都是通過細胞表面吸附這一途徑，進入到細胞中，然后利用細胞中的有效物質來繁殖。所以Vero細胞的大規(guī)模、高密度培養(yǎng)是生產過程中相當關鍵的一個步驟。本文重點是通過優(yōu)化并更加合理的設置生物反應器的運行參數(shù)，以達到更良好的生產條件。

表1 細胞培養(yǎng)情況表

表2 細胞培養(yǎng)情況表

1.材料與方法

1.1 主要材料

138-143代Vero細胞（美國ATCC），M199和DME培養(yǎng)基，細胞培養(yǎng)時加5% 新生牛血清，微載體為Cytodex1[2，3]。

1.2 主要儀器

生物反應器為美國EPPENDORF公司CelliGen510型生物反應器（40L），倒置顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 Vero細胞的復蘇準備：取第138代細胞，37℃乙醇浴融化；接種細胞到含有10%牛血清培養(yǎng)液的細胞瓶中，37℃培養(yǎng)；6～24小時后更換10%牛血清培養(yǎng)液；細胞代次為139代。

1.3.2 細胞培養(yǎng)：37℃、10%牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)，三次擴增達到可以進行生物反應器培養(yǎng)的細胞數(shù)量。

1.3.3 微載體的準備：按照15～20g/L生物反應器體積的比例稱量微載體，用PBS溶液浸泡并121℃濕熱滅菌60分鐘；滅菌后的微載體用培養(yǎng)液進行平衡，室溫浸泡72小時后使用。

1.3.4 生物反應器的準備：正確安裝培養(yǎng)液流加管、攪拌漿、沉降柱等配件；向生物反應器內加入注射用水，密封生物反應器并檢測氣密性。氣密性合格后在位濕熱滅菌121℃40分鐘；校正DO電極。

1.3.5 生物反應器細胞接種：觀察轉瓶內第142代細胞生長狀態(tài)，匯合率達到100%時用0.25%胰酶消化上述細胞，制成細胞懸液；收集的細胞懸液混合于微載體容器中，再無菌連接到生物反應器，正壓將細胞接種到生物反應器內。

1.3.6 生物反應器內細胞培養(yǎng)與正常生產的參數(shù)設置：40L反應器設定參數(shù)：溫度37℃、轉數(shù)38rpm、溶氧值（DO）15、pH值7.4、通氣量0.1～8.0。

2.結果

2.1 生物反應器不同轉數(shù)的持續(xù)培養(yǎng)對Vero細胞生長的影響，見表1。

2.2 生物反應器非正常轉數(shù)對Vero細胞生長的影響，見表2。

3.討論

微載體懸浮培養(yǎng)Vero細胞的生產工藝已應用到很多疫苗生產企業(yè)，這個技術平臺通過微載體對動物細胞進行高密度的培養(yǎng)可以達到很好的規(guī)模效應。本次實驗所用的是美國EPPENDORF公司生產的CelliGen510 型生物反應器，其是最新一代的生物反應器動物細胞培養(yǎng)平臺，以往生產的生物反應器體積多為5L、7.5L、30L，本次實驗所用CelliGen510 型生物反應器體積更大（40L），所以有著更好的經(jīng)濟效益。

通過生物反應器進行對Vero細胞和病毒進行大規(guī)模、高密度培養(yǎng)并通過此方式進一步生產相關疫苗，這一工藝雖然已應用到生產中去，但其整個工藝過程時間比較長（狂犬疫苗生物反應器連續(xù)運行過程達到20天，出血熱疫苗等品種更長），設備出現(xiàn)異常的概率相對較高。特別是生物反應器的攪拌系統(tǒng)，長時間的工作容易出現(xiàn)轉速波動等情況。高轉數(shù)的發(fā)生會提高系統(tǒng)的剪切力從而導致細胞損傷（動物細胞易受剪切力損傷），而低轉數(shù)會引起微載體沉積并使細胞無法生長，但細胞本身也有一定的耐受力，轉數(shù)在一定范圍內波動所引起的微小傷害可以恢復，且對細胞培養(yǎng)過程沒有太大的影響。通過數(shù)據(jù)可知，一定范圍內的轉數(shù)對細胞影響不是很大，但超過一定區(qū)間會有影響。短時間內的轉數(shù)波動在一定范圍內細胞有一定的耐受力，但超過一定的范圍會對細胞產生不可逆轉的傷害。

本次實驗中考察了生產過程中的轉速波動對微載體懸浮培養(yǎng)Vero細胞的影響，對于提高生產效率有十分重要的借鑒作用。

[1]查力，高軍，侯劍英，白珠穆，袁德明，楊俊偉，等.生物反應器細胞培養(yǎng)制備人用狂犬病疫苗中國生物制品學雜志，2006,19(3):288-290.

[2]CytidexTM 1: B eaded m icrocarriers for cell cu ltu re, Pharm acia FineChem icals, Technical Book let Seriw s,Uppsala, Sw eden 1978.

[3]VanW ezelAL. M icricarrier cu ltu res of an im al cells.In:K ruse PF,PatterssonMK, ed s. Tissu e cu ltu re: metbods and app lications. NewYork: A cadem ic Press,1973.372-377.