p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67在潰瘍性結腸炎2種中醫證型患者中的表達特點

汪 蕓，張 玲，曾 艷

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

論著

p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67在潰瘍性結腸炎2種中醫證型患者中的表達特點

汪 蕓，張 玲，曾 艷

(中國中醫科學院廣安門醫院，北京 100053)

目的探討脾胃氣虛證和濕熱內蘊證潰瘍性結腸炎(UC)患者腸黏膜活檢組織中p53、KRAS、APC蛋白及增殖指數Ki-67的表達特點和意義。方法根據中醫辨證分型及有無異型增生將64例UC患者分為脾胃氣虛證組23例，濕熱內蘊證組22例，脾胃氣虛證伴低級別異型增生組9例，濕熱內蘊證伴低級別異型增生組10例。選取同期腸鏡活檢組織呈輕度慢性炎者10例作為正常組，大腸癌患者11例作為大腸癌組。采用免疫組織化學方法檢測各組患者腸黏膜組織內p53、KRAS、APC蛋白及Ki-67表達情況。結果UC各組患者腸黏膜組織內p53蛋白表達陽性和Ki-67位于隱窩上1/2者的比例均明顯低于大腸癌組(P均<0.05)；脾胃氣虛證組和濕熱內蘊證組p53蛋白表達陽性和Ki-67位于隱窩上1/2者的比例基本相同；脾胃氣虛證伴低級別異型增生組p53蛋白表達陽性和Ki-67位于隱窩上1/2者的比例高于濕熱內蘊證伴低級別異型增生組，但差異無統計學意義；UC各組患者腸黏膜組織內均未見KRAS蛋白和APC蛋白表達。結論脾胃氣虛證伴低級別異型增生患者存在更高比例的腸黏膜上皮p53蛋白過表達及黏膜上皮增生活躍、缺乏成熟現象等癌變危險因素，對于脾胃氣虛證伴低級別異型增生患者應加強隨訪和腸鏡監測。

潰瘍性結腸炎；異型增生；p53蛋白；KRAS蛋白；APC蛋白；Ki-67

潰瘍性結腸炎(UC)是一種結直腸的慢性非特異性炎癥性疾病，病因尚不明確，復發率高[1]。病變范圍廣泛、病程長的UC患者發生UC相關性大腸癌(CAC)的風險增加，CAC也是UC最嚴重的并發癥之一，且預后不良[2]。因此，全面評估UC患者癌變風險，加強對高危患者的隨訪和監測是提高CAC早期診斷率，改善患者生活質量和預后的重要策略。CAC的發生經歷了炎癥—異型增生—癌的過程，對于首次隨訪的患者，明確腸黏膜有無異型增生及其類型和程度對進一步確定治療和隨訪方案具有指導作用，但是單純從形態學的改變對異型增生與慢性炎癥刺激引起的黏膜再生進行鑒別有一定困難，主要依靠觀察者的主觀判斷，缺乏客觀依據，因此常規病理觀察的同時檢測CAC相關標志物就顯得非常必要[3]。中醫辨證論治的臨床思維方法在UC治療中取得了很好的療效，積累了很多有益的臨床經驗。本研究從UC 2種常見中醫證型脾胃氣虛證和濕熱內蘊證入手，分析了1998年1月—2012年6月在我院住院且辨證為脾胃氣虛證和濕熱內蘊證UC患者的腸黏膜活檢組織中癌變相關蛋白p53、KRAS、APC及增殖指數Ki-67的表達特點，旨在為研究中醫證型與UC癌變關系，臨床中應用生物標志物對UC患者進行隨訪監測提供一定的依據。

1 臨床資料

1.1一般資料 依據中華醫學會消化病學分會炎癥性腸病協作組2007年制定的《對我國炎癥性腸病診斷治療規范的共識意見》[4]中的診斷標準，選取上述時期我院收治的UC患者64例，脾胃氣虛證和濕熱內蘊證診斷參照文獻[5]有關標準。患者均經過電子腸鏡檢查并取腸黏膜活檢。調取患者既往腸鏡活檢組織HE切片，由2位臨床病理主治醫師分別在光鏡下觀察，按照Riddell標準分類方法[6]確定有無異型增生并評價其程度，將患者進一步分為脾胃氣虛證組23例，濕熱內蘊證組22例，脾胃氣虛證伴低級別異型增生組9例，濕熱內蘊證伴低級別異型增生組10例。選取同期腸鏡活檢組織呈輕度慢性炎者10例作為正常組，大腸癌患者11例作為大腸癌組。

1.2免疫組織化學檢測方法 調取各組患者結腸鏡黏膜活檢石蠟包埋組織塊，切片常規脫蠟至水，3%H2O2滅活內源性過氧化物酶，EDTA(pH9.0)熱修復，5% BSA封閉液封閉沒有被抗原占據的空白點，滴加一抗標記，稀釋比例分別是：p53 1∶400，KRAS 1∶20，APC 1∶50，Ki-67 1∶100，4 ℃孵育過夜，滴加二抗標記，DAB顯色，蘇木素復染，梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光鏡觀察。免疫組化結果的評判標準：>5%的腸黏膜上皮細胞核呈中等或強棕黃色為p53蛋白表達陽性[7]；KRAS蛋白陽性信號定位于細胞膜，細胞膜呈中等或強棕黃色為KRAS蛋白表達陽性；APC蛋白陽性信號定位于細胞質，細胞質內呈中等或強棕黃色為APC蛋白表達陽性；Ki-67陽性信號標記細胞核，細胞核呈中等或強棕黃色為Ki-67表達陽性，根據Ki-67陽性信號的主要分布位置分別記為隱窩下1/2(隱窩基底部，干細胞所在區域)和隱窩上1/2(黏膜表面上皮，提示癌組織增生活躍，上皮細胞缺乏成熟現象)。

1.3統計學方法 數據應用SAS 6.0統計軟件進行統計處理，采用2檢驗和Fisher確切概率法進行組間各指標陽性表達率比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1各組患者腸黏膜組織p53蛋白表達情況 正常組未見p53蛋白表達，大腸癌組、脾胃氣虛證組、濕熱內蘊證組、脾胃氣虛證伴低級別異型增生組、濕熱內蘊證伴低級別異型增生組p53蛋白陽性表達率分別為63.6%(7/11)，4.3%(1/23)，4.5%(1/22)，44.4%(4/9)，20.0%(2/10)，脾胃氣虛證組和濕熱內蘊證組陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)；脾胃氣虛證伴低級別異型增生組陽性表達率有高于濕熱內蘊證伴低級別異型增生組的趨勢，但差異無統計學意義(P>0.05)。脾胃氣虛證組、脾胃氣虛證伴低級別異型增生組和大腸癌組免疫組化顯色表現見圖1～3。

2.2各組患者腸黏膜組織KRAS蛋白表達情況大腸癌組KRAS蛋白陽性表達率為36.4%(4/11)，其余組均未見KRAS蛋白表達。脾胃氣虛證組和大腸癌組腸黏膜組織KRAS蛋白表達染色表現見圖4及圖5。

2.3各組患者腸黏膜組織APC蛋白表達情況 大腸癌組APC蛋白表達陽性率為36.4%(4/11)，其余組均未見APC蛋白表達。脾胃氣虛證組和大腸癌組腸黏膜組織APC蛋白表達顯色表現見圖6及圖7。

圖1 脾胃氣虛證組腸黏膜組織p53蛋白表達顯色表現(×200)

圖2 脾胃氣虛證伴低級別異型增生組腸黏膜組織p53蛋白表達顯色表現(×200)

圖3 大腸癌組(中分化腺癌)腸黏膜組織p53蛋白表達顯色表現(×200)

圖4 脾胃氣虛證腸黏膜組織KRAS蛋白表達顯色表現(×200)

2.4各組患者腸黏膜組織Ki-67陽性信號分布情況 正常組、脾胃氣虛證組、濕熱內蘊證組Ki-67陽性信號均分布于隱窩下1/2；大腸癌組Ki-67陽性信號位于隱窩上1/2。脾胃氣虛證伴低級別異型增生組和濕熱內蘊證伴低級別異型增生組Ki-67陽性信號位于隱窩上1/2者(表現為接近表面上皮的細胞核呈連續彌漫分布的陽性)分別有2例(22.2%)和1例(10.0%)，但2組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖8及圖9。

圖5 大腸癌組(中分化腺癌)腸黏膜組織KRAS蛋白表達顯色表現(×200)

圖6 脾胃氣虛證組腸黏膜組織APC蛋白表達顯色表現(×200)

圖7 大腸癌組(中分化腺癌)腸黏膜組織APC蛋白表達顯色表現(×200)

3 討 論

目前研究顯示，具有低級別異型增生或不能確定的異型增生并在此后進展為高級別異型增生和/或CAC的UC患者，其p53蛋白表達陽性率明顯高于同期隨訪中沒有進展的患者；此外沒有發生異型增生的UC患者腸黏膜中也存在p53蛋白過表達，而且這些患者在隨訪中出現了低級別異型增生或不能確定的異型增生，甚至有些進展為高級別異型增生[7]。這些現象提示p53蛋白可以作為預測CAC相關異型增生是否發生和進展的生物標志物。本研究結果顯示，脾胃氣虛證伴低級別異型增生組患者腸黏膜上皮內p53蛋白陽性表達率有高于濕熱內蘊證伴低級別異型增生組的趨勢，雖然差異無統計學意義，但也提示出現低級別異型增生的脾胃氣虛證患者今后發生高級別異型增生和/或CAC的機會可能較濕熱內蘊證患者更高，脾胃氣虛證患者較濕熱內蘊證患者可能具有進展和/或癌變的更高風險，對那些腸黏膜上皮具有低級別異型增生且同時伴有p53蛋白過表達的患者應加強隨訪。另外，本研究發現脾胃氣虛證組和濕熱內蘊證組各有1例p53蛋白表達陽性，患者目前雖然還沒有出現異型增生，但也應注意腸鏡動態監測。

圖8 脾胃氣虛證伴低級別異型增生組腸黏膜組織Ki-67陽性顯色表現(×200)

圖9 大腸癌組(中分化腺癌)腸黏膜組織Ki-67陽性顯色表現(×200)

CAC病變過程中癌基因KRAS的激活發生在低級別異型增生向高級別異型增生發展的過程中[8]。另外CAC與散發性大腸癌發展過程中，各種分子事件的發生頻率和順序并不相同，由雜合性缺失或基因突變引起的APC基因滅活發生在UC癌變過程的晚期階段，而且出現頻率較低[9]。本研究結果顯示，除大腸癌組外，其余組患者腸黏膜活檢組織內均未見KRAS蛋白和APC蛋白表達，這與研究對象所處疾病階段有關。今后的研究中筆者將收集UC伴高級別異型增生的病例并對現有UC和UC伴低級別異型增生的患者進行隨訪，動態觀察KRAS蛋白和APC蛋白的表達情況，以此評估患者的病情和預后。正常大腸黏膜從基底至開口處可以分為增殖區、移行區和功能區，其中增殖區位于隱窩中下部，此處的干細胞不斷產生新細胞，并向黏膜表面移行、分化和成熟。Ki-67是一種核蛋白，是反映細胞增殖情況的標記物。相關研究發現，隨著UC患者腸黏膜異型增生程度的加重，Ki-67陽性分布位置也逐步向隱窩上部和表面移動，低級別異型增生患者腸黏膜上皮Ki-67陽性分布于隱窩的中上部分，而高級別異型增生患者分布于隱窩上部和表面上皮[10]。本研究中脾胃氣虛證伴低級別異型增生組和濕熱內蘊證伴低級別異型增生組共3例Ki-67陽性信號位于隱窩上1/2，且這3例p53蛋白表達陽性，提示聯合p53和Ki-67免疫組化檢測對判斷UC患者腸黏膜活檢組織內有無異型增生及程度具有臨床參考價值。

筆者之前的研究表明，從病程、病變范圍、炎癥程度及異型增生的角度分析，脾胃氣虛證UC具有癌變危險因素的患者比例明顯高于濕熱內蘊證，推測脾胃氣虛證UC患者的癌變風險較濕熱內蘊證UC患者更高[11]。本研究結果顯示，不伴低級別異型增生的2種證型之間p53、KRAS、APC及Ki-67的陽性表達率基本相同；而脾胃氣虛證伴低級別異型增生組p53蛋白表達陽性率和Ki-67表達陽性率均有高于濕熱內蘊證伴低級別異型增生組的趨勢，沒有統計學差異的原因可能由于本項目是基于中醫證型的臨床基礎研究，病例資料來源于中醫院住院患者，限定條件較多，造成伴有低級別異型增生的病例數量較少。今后筆者還要收集更多的相關病例，特別是伴有低級別異型增生和高級別異型增生的UC患者，深入進行UC脾胃氣虛證與以上CAC癌變標志物的相關性研究。

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Immunohistochemicalfeaturesofp53,KRAS,APCandKi-67inulcerativecolitispatientswithtwodifferenttypesofChinesetraditionalmedicalsyndromes

WANG Yun, ZHANG Ling, ZENG Yan

(Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100053, China)

ObjectiveIt is to explore the immunohistochemical features and its significance of p53, KRAS, APC and Ki-67 in the ulcerative colitis (UC) patients with two different types of Chinese traditional medical syndromes.Methods64 inpatients with UC were divided into four groups according to Chinese medical syndrome differentiation and classification with or without dysplasia: 23 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency (group A), 22 cases of syndrome of dampness-heat accumulation (group B), 9 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia (group C), 10 cases of syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia (group D). 10 cases with mild chronic inflammation in intestinal tissue were selected as normal group, 11 cases with colorectal cancer as colorectal cancer group. The expression of p53, KRAS, APC and Ki-67 was detected in every group by immunohistochemistry methods.ResultsThe proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in the patients in UC groups were significantly lower than that in colorectal cancer group (P<0.05). The proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in group A was the same as those in group B. The proportion of p53 over expression in intestinal mucosa and Ki-67 in the upper half of crypt in the patients in group C was higher than those in group D, but the difference was not significant. A negative KRAS and APC staining pattern were detected in all patients in UC groups.ConclusionThe UC patients with syndrome of spleen-stomach Qi deficiency with lower level dysplasia have a higher proportion of intestinal epithelial p53 over expression and high risk factors of cancer such as epithelial hyperplasia and lack of maturation, these patients should be given regular follow-up and colonoscopy screening.

ulcerative colitis； dysplasia； p53； Kras； APC； Ki-67

10.3969/j.issn.1008-8849.2018.01.001

R574.6

A

1008-8849(2018)01-0001-05

汪蕓，女，博士，主治醫師，主要從事消化道腫瘤的中西醫結合臨床基礎研究。

國家自然科學基金資助項目(81202804)

2016-08-10