通心方對冠心病患者外周血內皮祖細胞的影響

劉 征，馮其茂,董耀榮,樊 俊

(1. 上海中醫藥大學,上海 201203;2.上海中醫藥大學附屬中醫醫院,上海 200071)

通心方對冠心病患者外周血內皮祖細胞的影響

劉 征1，馮其茂2,董耀榮2,樊 俊2

(1. 上海中醫藥大學,上海 201203;2.上海中醫藥大學附屬中醫醫院,上海 200071)

目的探討通心方治療冠心病患者療效及對外周血內皮祖細胞(EPCs)數量、功能的影響。方法將48例冠心病患者隨機分成對照組和治療組，每組24例。對照組在西醫常規治療基礎上加服麝香保心丸，治療組在西醫常規治療基礎上加服通心方，2組療程均為3個月。觀察2組治療前后外周血EPCs數量、功能的變化，統計2組臨床療效。結果治療3個月后，2組EPCs數量均明顯高于治療前(P均<0.05)，且治療組明顯高于對照組(P<0.05)。對照組EPCs增殖活力OD值從治療第4天開始明顯高于治療前(P<0.05)；治療組EPCs增殖活力OD值于治療第1天開始明顯高于治療前(P<0.05)，從第5天開始出現對數增殖期，且第5—7天明顯高于對照組(P均<0.05)。治療組總有效率明顯高于對照組(P<0.05)。結論通心方能刺激冠心病患者骨髓釋放更多的EPCs到外周血，能顯著提高外周血EPCs的增殖能力，改善患者臨床癥狀，其效果優于麝香保心丸。

通心方；冠心??；內皮祖細胞

冠心病(CHD)是指由于冠狀動脈粥樣硬化，導致血管發生狹窄或阻塞，從而致使心肌缺氧缺血甚至壞死而發生一系列臨床表現的病癥。血管內皮損傷是冠心病發生的病理生理基礎,被認為是動脈粥樣硬化形成的早期環節,損傷的血管內皮周邊趨化炎性細胞,造成血管壁硬化及狹窄,進一步造成血管內皮修復障礙。內皮祖細胞(EPCs)作為一種干細胞，在一定的條件下可分化為血管內皮細胞，具有促進缺血組織血管再生和血管內皮化，抑制血栓形成和冠狀動脈支架植入后再狹窄的作用[1]，但EPCs移植治療冠心病的效果卻不理想[2]。本課題組早期臨床研究證實，通心方能顯著改善冠心病患者的側支循環和射血分數[3]，能改善冠心病嚴重三支病變患者的心室重構和心室舒張功能[4]，對于廣泛彌漫性病變、失去介入和搭橋機會的嚴重冠心病患者顯示出較好臨床療效。本研究進一步觀察了通心方對冠心病患者外周血EPCs數量及功能的影響，旨在探討該方治療冠心病的可能作用機制。

1 臨床資料

1.1一般資料 收集2015年7月—2016年10月就診于上海市中醫醫院心內科和急診科的冠心病患者48例，年齡40～95歲，均經冠狀動脈造影確診(至少1支血管狹窄>50%)，經心內科、心外科診斷不適合進行冠脈支架植入術和冠脈搭橋術，或患者及家屬放棄行冠脈支架植入術和冠脈搭橋術。中醫辨證為氣虛血瘀證，氣虛主癥為神疲乏力、心悸氣短、面色少華，血瘀主癥為胸部固定刺痛、舌質紫暗[5-6]。排除年齡40歲以下或95歲以上者；心功能Ⅳ級或肺水腫者；嚴重肝腎功能不全者；對中藥過敏者；伴發惡性疾病、嚴重炎性疾病、出血性疾病者；惡性心律失常、急性冠脈綜合征、不穩定型心絞痛者；妊娠或哺乳期婦女；老年癡呆者?；颊呒凹覍僭敢夂献?，且研究經上海市中醫醫院倫理委員會通過。采用隨機分組的方式將入選者隨機分成對照組和治療組，每組24例，2組一般資料比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，見表1。

表1 2組一般資料比較

1.2治療方法 2組患者均根據病情給予血小板抑制劑、硝酸酯類、β受體阻滯劑、他汀類藥物、血管緊張素轉化酶抑制劑、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑、鈣離子阻滯劑等常規治療。在常規治療基礎上，治療組給予通心方治療，組方：黃芪30 g、川芎12 g、桃仁15 g、地鱉蟲12 g、三棱15 g、牡蠣40 g、桂枝12 g、枳殼12 g、夏枯草12 g，每日1劑,由上海市中醫醫院制劑科制成水煎劑,分2次口服，每次150 mL；對照組給予麝香保心丸(上海和黃藥業有限公司，國藥準字 Z31020068)口服，每次2粒，每日3次。2組療程均為3個月。

1.3檢測指標及方法

1.3.1EPCs數量 參照文獻[7]方法，采用密度梯度離心法從人外周血提取單個核細胞，用體外誘導方式進行培養。具體方法：分別于治療前后取2組患者外周靜脈血8 mL，經抗凝后，加入淋巴細胞分離液，在室溫下，以300 g離心30 min。取中層細胞分層液與血漿交界部位混濁的灰白色層獲取單個核細胞。將獲取的單個核細胞懸液用Hank's 液洗滌2 次，1 500 r/min 在室溫下離心5 min，吸取上清，加入含10%胎牛血清、ECGS 100 mg/L的RPMI-1640 培養液。以(2～3)×106個/mL密度重懸單個核細胞于預先準備好的纖維連接蛋白包被的6孔板，每孔2 mL。置于5%CO2、37 ℃孵育箱中培養,每隔3 d更換1次含胎牛血清和ECGS的培養基。培養至第14天收集貼壁EPCs細胞。將收集的EPCs細胞計數后用PBS溶液稀釋，調整待檢測細胞濃度為106個/mL,分別重懸于A、B兩管中。A管為陰性對照管只加100 μL細胞懸液，B管加入100 μL細胞懸液、FITC標記的CD34(20 μL)、PE標記的VEGF-2(20 μL)、PE-CY5標記的CD45(20 μL)。4 ℃避光孵育1 h。孵育結束后所有檢測管進行離心(1 000 r/min,10 min)，棄上清，沉淀用400 μL PBS重懸，使用流式細胞儀進行檢測。分析每10 000個細胞中以 CD34陽性、VEGF-2陽性、CD45陰性標記細胞的百分比作為EPCs占外周血中有核細胞的百分比。

1.3.2EPCs增殖能力 將培養14 d的細胞經胰蛋白酶消化，制成(1～5)×104個/mL的細胞懸液，接種于96孔培養板，設3個復孔，設一空白對照孔，置于5%CO2、37 ℃孵育箱。每天取1 板，檢測EPCs增殖能力，連續7 d。具體方法：將Cell Counting Kit-8(CCK-8)和無血清必需基本培養基按1:10體積混合，每孔100 μL加入待測孔中，在37 ℃、5%CO2培養箱中孵育1 h，用酶標儀測定450 nm波長吸光度，記錄每塊板的OD值，繪制生長曲線。

1.3.3臨床療效 根據中醫證候積分計算療效指數[(治療前積分-治療后積分)/治療前積分×100%]，根據療效指數評定療效。顯效：70%≤療效指數<90%；有效：30%≤療效指數<70%；無效：療效指數<30%。顯效+有效為總有效。

2 結 果

2.12組治療前后EPCs數量比較 2組治療前EPCs數量比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療3個月后，2組EPCs數量均明顯高于治療前(P均<0.05)，且治療組的EPCs數量明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 2組治療前后EPCs數量比較%)

注：①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

2.22組治療前后EPCs增殖能力及生長曲線比較2組治療前EPCs增殖活力均低下，OD值呈緩慢上升趨勢，2組各時間段 OD值比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。對照組EPCs增殖活力OD值從治療第4天開始明顯高于治療前(P<0.05)；治療組EPCs增殖活力OD值于治療第1天開始明顯高于治療前(P<0.05)，從第5天開始出現對數增殖期，且第5—7天明顯高于對照組(P均<0.05)。見表3及圖1。

表3 2組治療前后EPCs增殖能力比較

注:①與治療前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

圖1 2組治療前后EPCs生長曲線比較

2.32組臨床療效比較 對照組顯效3例，有效12例，無效9例，總有效率63%；治療組顯效8例，有效14例，無效2例，總有效率92%。治療組總有效率明顯高于對照組(P<0.05)。

3 討 論

冠狀動脈搭橋術、經皮冠脈球囊擴張術和支架植入術已經成為冠心病和急性心肌梗死的主要治療手段，但仍有30%的嚴重冠脈病變如閉塞病變、彌漫病變、三支血管病變、嚴重鈣化、嚴重血管扭曲等患者不適合冠脈搭橋術和介入治療，或因各種原因不愿意手術或支架植入。因此重建血管內皮功能、增強EPCs內皮修復功能成為防治心血管損傷性疾病的全球研究熱點。

EPCs大量存在于骨髓及臍血中，僅少量釋放到外周血。當內皮功能受到損傷時，能刺激骨髓釋放大量EPCs到外周血,并能定向遷移到受損血管內皮處，對損傷的血管內皮進行修復[8]，分泌促血管生長因子促進局部缺血灶血管新生。冠心病患者外周血中 EPCs數量減少,EPCs功能低下,提示EPCs修復損傷的血管內皮能力降低[9-10]。另外EPCs的數量與心血管疾病致死風險呈負相關，檢測EPCs數量可用于預測心血管事件的發生[11]。然而EPCs移植治療冠心病的效果卻不理想，分析原因可能為受體心肌對治療不接受，被注射到心臟局部細胞在局部停留短暫，很快被遷移到肺、脾和其他器官，停留于局部的細胞通常死亡，局部存活的細胞不能與原有心肌細胞協調起作用[2]。

近年來,祖國醫學通過抑制血管炎癥、重建血管內皮功能、促進血管新生等途徑(即所謂的藥物搭橋)治療冠心病取得了一定進展[12-14]。傳統中醫學認為冠心病屬于“胸痹心痛病”范疇,其病機復雜多變，概括為寒凝、氣滯、血瘀、氣虛、痰濁、陰陽俱損，其中氣虛血瘀是冠心病最為常見的病機。麝香保心丸即根據該病機所研制，且臨床證實其能夠促進冠心病患者EPCs的動員過程，機制可能與麝香保心丸改善患者的血管內皮功能，增加NO的合成有關[15]。故本研究選擇麝香保心丸作為對照藥物。而本課題組在多年臨床實踐和研究的基礎上, 結合冠心病具有“久病入絡,久病必瘀,久病傷氣”的特點,提出“活血通絡、益氣通陽”論治冠心病的觀點，創制了通心方。方中黃芪、川芎、桂枝益氣行血、溫通心陽,桃仁、地鱉蟲、牡蠣、三棱活血破血，夏枯草軟堅散結，枳殼理氣寬中，以氣行血，加強活血通絡之功,諸藥合用共奏益氣活血通絡、溫通心陽之功效,標本兼顧?，F代藥理學研究證實黃芪具有明顯正性肌力作用，能保護血管內皮細胞，促進血管內皮細胞的遷移與增生,具有促進側支循環生成、加速梗死灶愈合的作用[16]。黃芪的主要有效成分黃芪甲苷可增加體外培養的EPCs數量，改善EPCs增殖、遷移、黏附和體外血管生成能力[17]。川芎的主要成分川芎嗪具有提高機體內NO水平和降低ET-1水平，從而保護損傷的血管內皮功能作用，而完整的血管內皮功能可促進EPCs、VEGF、FGF等多種促血管生成因子釋放[18]。桃仁、地鱉蟲、牡蠣可以調節血脂，改善高膽固醇血癥[19-21]。夏枯草具有一定的抗炎及擴張血管,增加冠脈血流的作用[22]。

骨髓中 EPCs表面標記有3種，即CD133、CD34和VEGFR-2,而外周血中EPCs提取培養后分化成熟，CD133表達逐漸減少甚至缺失，但繼續表達CD34和VEGFR-2[23]；CD45則是白細胞的表面標記物，在EPCs中基本不表達。因此,本實驗以表達CD34和VEGFR-2雙陽性并且CD45表達陰性的細胞鑒定為EPCs。結果顯示，治療3個月后，2組EPCs數量均明顯升高，且治療組明顯高于對照組；2組治療前EPCs增殖上升緩慢、無對數上升期，提示EPCs活力低下；對照組EPCs增殖活力OD值從治療第4天開始明顯高于治療前；治療組EPCs增殖活力OD值于治療第1天開始明顯高于治療前，從第5天開始出現對數增殖期，且第5-7天明顯高于對照組；治療組總有效率明顯高于對照組。說明通心方可刺激冠心病患者骨髓釋放更多的EPCs到外周血，能顯著提高外周血EPCs的增殖能力，引導EPCs歸巢到缺血心肌區修復損傷血管內皮，改善缺血灶的血管內皮功能，促進釋放促血管生成因子，加速建立側支循環為缺血心肌提供血供，進而改善患者的心功能及臨床癥狀，且效果優于麝香保心丸，值得臨床推廣使用。

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EffectofTongxinprescriptionontheendothelialprogenitorcellsinperipheralbloodofpatientswithcoronaryheartdisease

LIU Zheng1, FENG Qimao2, DONG Yaorong2, FAN Jun2

(1. Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203; 2. Shanghai Municipal Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200071)

ObjectiveIt is to investigate the curative effect of Tongxin Prescription on the number and function of endothelial progenitor cells in peripheral blood of patients with coronary heart disease.MethodsForty-eight patients with coronary heart disease were randomly divided into control group and treatment group, each group had 24 cases. The control group was treated with normal western medicine combined with Shexiang Baoxin Pill, while the treatment group was treated with normal western medicine combined with Tongxin prescription. Both groups were treated for 3 months. The clinical efficacy was evaluated,the changes of the number and function of endothelial progenitor cells in peripheral blood were observed before and after treatment in the two groups.ResultsAfter three months of treatment, the number of endothelial progenitor cells in the two groups was higher than that before treatment, the number of endothelial progenitor cells in the treatment group was significantly higher than that in the control group (P<0.05). The OD of proliferation ability of endothelial progenitor cells from the fourth day was significantly higher than that before treatment in the control group (P<0.05), and the OD from the first day was significantly higher than that before treatment in the treatment group (P<0.05), furthermore,logarithm phase occurred from the fifth day, and the OD was higher in the treatment group than that in the control group from fifth to seventh day (P<0.05). The total effective rate in the treatment group was obviously higher than that in the control group (P<0.05).ConclusionTongxin Prescription can stimulate the bone marrow to release more endothelial progenitor cells to the periphery, significantly enhance the proliferation ability of peripheral blood cells and improve the clinical symptoms in the patients with coronary heart disease, its effect is better than that of Shexiang Baoxin pill.

Tongxin Prescription; coronary heart disease; endothelial progenitor cells

10.3969/j.issn.1008-8849.2018.01.002

R541.4

A

1008-8849(2018)01-0005-05

劉征，女，博士研究生在讀，研究方向為心血管內科疾病診治。

馮其茂，E-mail：fenqimao@126.com

上海市自然科學基金項目(13ZR1439900)；中國博士后科學基金面上項目(2014M550131)

2017-02-15