我國黑木耳國認品種種質基礎及黑木耳育種技術現狀

龐 杰， 孫國琴， 王海燕， 于 靜， 康立茹， 謝亞杰

(1.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古呼和浩特 010030； 2.食用菌內蒙古自治區工程研究中心，內蒙古呼和浩特 010030)

黑木耳[Auriculariaauricular(L. ex Hook.) Underw]是我國重要的食用菌生產種類，隸屬于擔子菌亞門(Basidiomycotina)、層菌綱(Hymenomycetes)、木耳目(Auriculariales)、木耳科(Auriculariaceae)、木耳屬(Auricularia)的可食用大型真菌，木耳屬全世界約50種，我國約10種[1]。

黑木耳在我國種植歷史悠久，早在北魏時期的《齊民要術》就記載了木耳生產。黑木耳生產規模巨大，據中國食用菌協會統計，2014年我國黑木耳產量為579萬t，較上一年的556.39萬t同比增長4%，生產規模已經超越平菇，成為繼香菇之后的第二大食用菌生產種類。

黑木耳生產同其他的農業生產相同，優質的品種是黑木耳高產高效的基礎保障。所謂作物新品種選育就是人為的作物種質重組，作物種質重組的基礎是需要不同來源和遺傳背景的種質資源[2]。本研究收集了23個國認黑木耳品種的詳細信息，對我國國認黑木耳的遺傳基礎進行分析，旨在了解我國國認黑木耳品種現狀，此外，分析了我國黑木耳育種的基本技術手段和現狀，為進一步開展黑木耳育種研究提出方向。

1 國認黑木耳品種的遺傳基礎

根據全國農業技術推廣服務中心公布的黑木耳品種名單[農技種便函(2015) 60號]，收集黑木耳國認品種的相關信息(表1)。23個國認黑木耳品種中，分離馴化的品種有18個，占到總品種的78.3%，雜交選育的品種有5個，僅占總品種數的21.7%。23個國認品種中， 總體可以分為兩大群體，分別是東北群體和華中南群體。東北群體來源我國東北地區，包括的地區有黑龍江、吉林、遼寧和內蒙古東部，品種有15個；華中南群體來源于浙江、湖南、湖北大巴山等地區，包括的品種有6個；品種H10由東北群體和華南群體雜交而成，浙耳1號品種未標注來源地區。國認品種中，有明確親緣關系的是黑耳5號(Au86)和黑耳4號(931)，黑耳4號以黑耳5號和黑龍江呼瑪野生黑木耳品種為親本，通過雙核菌絲脫壁再生育成。可以看出，目前我國國認黑木耳品種以分離馴化為主，育種技術落后，品種的遺傳基礎較為單一。我國國認黑木耳品種沒有明確的骨干品種。

表1 23個國認黑木耳品種的詳細信息

2 我國黑木耳育種技術現狀

黑木耳是一種可食用的大型真菌，在生產中與植物不同的是其通過純菌絲體營養繁殖產生后代，生產中的菌種也不是植物學中常規定義的種子，而是一個特殊的生長狀態。但是無論如何生產，品種選育都是實現黑木耳高產高效生產的基礎。

2.1 組織分離

通過分析國認品種的來源可以看出，我國國認黑木耳品種來源絕大多數是組織分離。這是由于黑木耳物種特性和組織分離是一種簡單快捷的技術手段共同造成的。通過組織分離獲得的黑木耳純菌絲體可以直接用于生產，優質的種質可以直接用于品種的審定。所以，組織分離是獲得優質黑木耳種質、品種的快捷方式。

黑木耳組織分離主要包括3種主要方式，分別是孢子分離、子實體組織分離、耳木菌絲分離。孢子分離是將黑木耳耳片簡單消毒滅菌后，懸掛在培養基上方，通過孢子掉落，獲得純的菌絲體；子實體分離是將黑木耳子實體消毒后，直接放置在培養基上萌發生長，獲得純的菌絲體；耳木分離是分離野外椴木上生長的黑木耳菌絲體，在培養基上獲得純培養，從而用于生產。上述技術簡單易得，是黑木耳菌種獲得和開展黑木耳新品種選育的基礎技術。

在黑木耳組織分離中，關鍵是組織滅菌，滅菌不到位，會影響到組織的萌發和菌絲體的最終使用。目前基本的滅菌方式有75%乙醇[3]、0.01%氯化汞[4]和2%次氯酸鈉，以及培養基中加入青霉素、鏈霉素、慶大霉素等抗菌藥物[3]，抑制細菌生長。此外，李曉等發現加入青霉素、鏈霉素不僅有抗菌作用，還能夠促進黑木耳菌絲的萌發[5-6]，但其原因還未見報道。

2.2 雜交選育

雜交育種是一項成熟的育種技術，是指不同基因型的親本菌株之間通過基因的自由組合、交換或其他方式產生兼有雙親優點的新的基因型[7]。這類型的基因重組是將雙親控制不同性狀的優良基因結合于一體，或將雙親中控制同一性狀的不同微效基因積累起來，產生在各該性狀上超過親本的類型。通常論述的雜交育種在食用菌中一般指的是單核菌株雜交育種，單核菌株雜交選育又可以分為單孢雜交、雙單雜交、多孢雜交[8]。單孢雜交指的是把從子實體中收集的單核孢子菌絲體，或者通過原生體單核化技術獲得的原生質體單核體菌絲，將兩者中具有不同基因型或者生態型的單核體之間進行配對雜交[9]。國認品種滬耳4號、吉雜1號和豐收2號都是通過單孢雜交獲得。福山等采用單孢雜交技術選育出了黑木耳優良菌種遼八號[10]；李曼霞報道，單孢雜交技術選育出了黑木耳優良菌種陜耳1號[11]。雙單雜交也就是布勒現象，當單倍體的初生菌絲與異核的非單倍體的次生菌絲發生雜交時，初生菌絲中的細胞核接受次生菌絲中的核而轉變成次生菌絲的現象，目前雙單雜交在金針菇上應用較多[12]。多孢雜交顧名思義指的是將很多孢子放到一起并在同一時間內進行雜交，然后從中挑選雜交菌株[13]。李省印等報道了通過多孢雜交育成了黑木耳新品種陜耳3號[14]。

單核菌株雜交選育關鍵內容是獲得有效的單核菌株及開展合理高效的配對工作。食用菌有性生殖生殖可以分為同宗結合和異宗結合，黃亞東等研究結果表明，黑木耳是一種二級性異宗結合，因此在雜交組合中有50%的可能為不育[15-16]。目前關于黑木耳單核菌種研究主要集中在如何獲得和高效鑒定方面，對于黑木耳單核菌株高效配對研究和性狀分離研究相對較少，還處在雜交育種的初級階段。韓增華等研究發現，熒光核染色技術可快速有效地鑒定黑木耳菌株的核相，脂酶同工酶技術可快速、準確地區分黑木耳單核菌株及雜交新菌株的不同核型，研究得到了1個酶帶差異顯著的黑木耳新菌株[17]。劉桂娟等研究發現在光學顯微鏡下通過觀察黑木耳菌絲有無鎖狀聯合來鑒定單、雙核菌絲不夠準確，光學顯微鏡鏡檢不能作為鑒定菌株單、雙核的唯一依據，結合雙重熒光染色鏡檢能更準確地鑒定菌株鎖狀聯合的有無；并且提出了雜交菌株真實性鑒定法[1]。張偉琳利用HW5號和139號2株遠源性大的優良黑木耳菌種作為親本菌株制備原生質體菌株和孢子菌株，利用熒光顯微鏡和簡單重復序列(ISSR)分子標記技術以及酯酶同工酶法來確定菌株單、雙核及交配型，分別獲得20個孢子單核菌株和2種交配型的原生質體單核菌株，用這2種單核菌株進行配對雜交，最終共獲得6個雜交菌株[18]。韓增華等研究發現，酯酶同工酶譜及RAPD圖譜結果可以將互補型條帶和親本條帶清晰明確地區分開來，單核體單-單雜交獲得核型為A1B2的雜交菌株，與親本981的相似度高于親本8808[19]。

2.3 原生質體融合育種

原生質體融合育種也可以理解為雜交育種，但其育種所用的材料是食用菌菌絲體生長的一個特殊階段或者是通過技術手段從正常菌絲體細胞中獲得的。國認菌種黑耳4號(931)(國品認菌2007019)就是通過原生質體融合育種技術獲得。所謂原生質體融合育種技術指的是將具有遺傳差異的沒有細胞壁的單核原生質體，在融合劑的誘導下完成融合，使基因組發生部分或全部的交換和重組[20]。單核原生質體的來源可以分為自然產生的單核原生質體和人工處理產生的單核原生質體。自然生長狀態下，異宗結合的蕈菌都具有原生質體單核化的現象，通過分離得到這些單核原生質體，并將單核原生質體應用在遺傳育種之中[18]。人工處理產生單核原生質體就是通過蝸牛酶液、溶壁酶液及果膠酶液等分解細胞壁[21]，從而獲得單核原生質體。大量學者對黑木耳原生質體制備等技術開展了研究[22-27]，唐玉琴報道，通過原生質體技術選育出了黑木耳新品種雙高一號[28]。

邱敦蓮等認為，茶樹菇單核原生質體產生的同一交配型群體中，群落形態、菌絲生長速度、羥甲基纖維素酶相對活性和酯酶同工酶形狀都具有相對的穩定性，變異范圍小，說明親本形狀不易在原生質體中分散和稀釋，在育種程序中可以從一個比較小的變異范圍內選擇具有親本形狀的不育單核體，有效地克服了傳統育種過程中由孢子單核體遺傳多樣性所造成的親本形狀分散和選材困難的障礙，減少了篩選雜交后代的工作量[29]。譚琦等利用RAPD技術，對香菇孢子單核體和原生質體單核體的遺傳差異變化進行了分析，結果表明以交配型基因為標記的孢子單核體遺傳變異大于原生質體單核體，同種交配型的孢子單核體遺傳相似性分別為66.3%、71.7%，而原生質體單核體的遺傳相似性分別為98.7%、93.7%[30]。因此，通過原生質體單核化可以獲得更接近親本形狀的育種材料，可以更快速地將一些優良形狀整合在一起，從而獲得優質的品種。黑木耳上關于單核原生質體遺傳變異情況的分析還未見報道。

2.4 其他育種技術

除上述主要的育種技術手段外，黑木耳育種技術還包括誘變育種和生物工程育種。所謂誘變育種利用包括物理、化學以及生物、空間等誘變因子，使原黑木耳菌種中的遺傳物質發生突變，進而使一部分菌株的遺傳性狀發生改變的技術手段[31]。賈建航等將黑木耳等食用菌材料進行衛星或高空氣球搭載，通過地面研究拮抗反應、菌絲生長速度、出菇形態等方面發現，高空搭載材料出現明顯變異，RAPD研究也證實一些搭載菌株在DNA水平發生了變異[32]。但是誘變過程中育種材料的變異方向不可控，隨機性大，經過誘變處理后需要開展大量的試驗進行分析變異方向。生物工程育種是目前育種技術的前沿，在植物育種中，目標育種成為發展的趨勢。所謂生物工程育種是在分子水平上對菌株進行操作，獲得具有特定遺傳性狀的新菌株。基因工程技術給黑木耳的可控育種方式開辟了新的方向，整合一些黑木耳中不具備但是對于黑木耳高產高效生產重要的基因，滿足人們及市場的需要，這種新型的可控制的育種手段將在黑木耳育種工作中發揮著極其重要的作用。但是目前，食用菌中大多數重要性狀都是數量性狀，如菌絲生長速度、生育期、子實體形態、酶活性、單菇質量以及產量等，與質量性狀不同，數量性狀受多基因控制，遺傳基礎復雜，易受環境影響，表現為連續變異，表型和基因型間沒有明確的對應關系，常規的育種手段難以實現數量性狀的遺傳改良[33]。

總體來說，黑木耳雜交育種技術研究相對薄弱，對雜交育種的機理機制性問題研究較少，如菌絲特性、子實體特性的孢子分離規律，目標性狀的基因控制方式，黑木耳遠緣雜交技術突破等等內容。上述研究內容的缺失，嚴重地制約著黑木耳雜交育種的大規模開展。

3 黑木耳育種研究方向和重點工作

食用菌既不像細菌等原核生物，又不同于高等植物等真核生物，形成了較為特殊的遺傳行為和生活史特性[34]，但是新品種選育同樣是食用菌高產高效生產的基礎環節和重要環節。現階段落實黑木耳供給側改革就是要減少黑木耳生產數量，提高黑木耳生產效率，降低黑木耳生產成本，提高黑木耳生產質量。這個目標的實現依然要依靠優質的黑木耳品種。通過綜合以上信息，黑木耳育種工作的重點有以下幾個方面：

3.1 擴大黑木耳種質資源種群，豐富品種的遺傳背景

種質資源是新品種選育的基礎，豐富的遺傳背景是高效優質品種的基礎。目前我國國認黑木耳品種的遺傳基礎主要來源于我國東北群體和華中南群體，并且兩大群體種質資源相互雜交較少，各地區適宜的品種都是從本地區種質資源中選育獲得，減少了種質資源間的交流和互換。通常來講，雜交組合中較遠的親緣關系能夠獲得較強的雜種優勢。因此，有必要擴大黑木耳種質資源的種群，豐富品種的遺傳背景，實現黑木耳品種的高產和高效生產。

3.2 開展黑木耳產量形成規律研究

產量形成規律是實現黑木耳高產高效栽培的基礎理論，只有探明黑木耳產量形成規律，才能指明黑木耳優良品種選育的目標。黑木耳產量形成規律內容應該包括黑木耳菌種活力機理、黑木耳培養料降解機理、黑木耳成耳生理等方面。通過探明黑木耳產量形成規律，有針對性地選擇菌種活力高、培養料降解徹底、容易出耳的種質資源，從而選育出優質、高效的黑木耳品種。

3.3 開展雜交育種的基礎關鍵技術研究

在雜交育種中，基礎技術是雜交育種的中間關鍵環節，探明了這些中間關鍵環節的基本原理，開展雜交組合配對只是獲得優質品種的重復性配對工作。在黑木耳雜交育種基礎研究中，目前集中在單核菌株的獲得和鑒定方面，關于單核菌種的性狀規律和單核菌株親和性方面研究較少。通過大量的基礎理論研究，探明黑木耳在形成孢子過程中性狀的分離規律和單核菌株親和性規律，探明優質性狀在原生質體單核化過程中的分離、組織規律，以提高黑木耳優質菌種的育成效率。此外，開展黑木耳雜種優勢機理、優良性狀的基因定位和性狀控制基因分析，為黑木耳目標育種工作奠定基礎。

3.4 開展黑木耳雜交品種選育研究

趙厚坤等認為經過多次的擴繁，菌種就會出現產量低、品質差、抗逆性差、發病率高，甚至不出耳的嚴重后果；經過有性繁育出的菌種，完全可以突破母本的優良性狀，在各方面的表現都優于母本[35]。此外，雜種優勢也是目前食用菌新品種選育的重要應用方面。通過大力開展黑木耳雜交育種，特別是不同種群間的雜交育種，擴大雜種優勢，選育出優質、高效的黑木耳新品種。

[1]劉桂娟，姚方杰，陳 影，等. 黑木耳雜交菌株選育及其鑒定方法[C]//第九屆全國食用菌學術研討會摘要集. 北京：中國菌物學會，中國農學會食用菌分會，2010.

[2]黎 裕，李英慧，楊慶文，等. 基于基因組學的作物種質資源研究：現狀與展望[J]. 中國農業科學，2015，48(17)：3333-3353.

[3]尹曉宇，張興梅. 黑木耳組織分離改進方法研究[J]. 黑龍江農業科學，2015(3)：132-134.

[4]李云龍，劉 柱. 黑木耳的組織分離技術[J]. 浙江食用菌，2008，16(3)：41.

[5]李 曉，孟秀秀，代月婷，等. 黑木耳簡單快速組織分離新法[J]. 中國食用菌，2014，33(6)：11-12.

[6]宋素珍，商進才. 黑木耳組織分離的新消毒法[J]. 食用菌，1991(1)：38.

[7]付立忠，吳學謙，魏海龍，等. 我國食用菌育種技術應用研究現狀與展望[J]. 食用菌學報，2005，12(3)：63-68.

[8]閻培生，羅信昌，周 啟. 木耳屬種的分子系統發育關系研究[J]. 吉林農業大學學報，1998，20(增刊)：77-80.

[9]陳世通，白建波，蒲 敏，等. 香菇單孢雜交及雜交菌株分子鑒定[J]. 食用菌學報，2013，20(1)：1-8.

[10]福 山，韓 麗. 黑木耳優良菌種“遼八號”選育成功[J]. 特產科學實驗，1987(3)：17.

[11]李曼霞. 黑木耳新菌種陜耳1號[J]. 西北農業學報，1993(1)：33.

[12]王 波，祁麗萍，賈定洪，等. 金針菇雙-單雜交遺傳機理分析[C]//第十屆全國食用菌學術研討會論文匯編. 北京：中國菌物學會，2014.

[13]桑 峰. 木耳優良雜交菌株的初步篩選[D]. 武漢：華中農業大學，2011.

[14]李省印，常楊生，胡彩霞，等. 代料地栽黑木耳新品種‘陜耳3號’[J]. 園藝學報，2004，31(4)：565-565.

[15]黃亞東. 木耳的極性研究[D]. 武漢：華中農業大學，2004.

[16]肖 揚. PCR技術在黑木耳交配型因子研究中的應用[D]. 武漢：華中農業大學，2005.

[17]韓增華，張丕奇，戴肖東，等. 黑木耳親本、單核、雜交菌株鑒定的研究[J]. 菌物研究，2009，7(2)：99-103.

[18]張偉琳. 黑木耳單核雜交菌株遠源性的研究[D]. 哈爾濱：黑龍江大學，2011.

[19]韓增華，張介馳，張丕奇，等. 黑木耳單核雜交菌株遺傳分析[J]. 核農學報，2015，29(5)：843-848.

[20]Zhao J，Chang S T. Monokaryotization by protoplasting heterothallic species of edible mushrooms[J]. World Journal of Microbiology and Biotechnology，1993，9(5)：538-543.

[21]陳文強，王 進，鄧百萬，等. 秦巴山區黑木耳主要栽培種內原生質體分離與融合[J]. 食品與生物技術學報，2014，33(8)：856-864.

[22]趙有鑫，唐玉琴. 原生質體融合技術在黑木耳育種上的研究進展[J]. 吉林農業C版，2011(4)：69-69.

[23]許修宏，孟 琦，劉華晶，等. 黑木耳菌絲原生質體的制備再生及單核鑒定研究[J]. 東北農業大學學報，2011，42(8)：96-100.

[24]郭硯翠，劉鳳春，王雅茹，等. 黑木耳原生質體再生株選育高產菌株研究[J]. 食用菌學報，1994，1(2)：7-10.

[25]韓增華，張丕奇，戴肖東，等. 黑木耳原生質體制備、再生及單核體熒光鑒定[J]. 食用菌學報，2008，15(3)：13-17.

[26]楊國良，楊秀琴，楊曉仙，等. 毛木耳與黑木耳的原生質體融合育種[J]. 中國食用菌，1990(4)：14-16.

[27]李 楠，許修宏. 黑木耳原生質體制備及再生的研究[J]. 東北農業大學學報，2009，40(7)：34-37.

[28]唐玉琴. 通過原生質體技術選育的黑木耳新品種“雙高一號”品比研究[J]. 北方園藝，2014(24)：153-154.

[29]邱敦蓮，劉本洪，肖在勤，等. 茶樹菇原生質體的分離和再生以及單核菌株的篩選[J]. 西南大學學報(自然科學版)，2008，30(12)：116-120.

[30]譚 琦，楊建明，陳明杰，等. 香菇孢子單核體與原生質體單核體遺傳差異分析[J]. 中國食用菌，2001，20(6)：3-5.

[31]付立忠，吳學謙，魏海龍，等. 我國食用菌育種技術應用研究現狀與展望[J]. 食用菌學報，2005，12(3)：63-68.

[32]賈建航，金德敏，邊銀丙，等. 食用真菌空間誘變育種研究[J]. 食用菌學報，1998，5(4)：13-18.

[33]龔文兵，肖 揚，周 雁，等. 食用菌QTL定位研究進展[J]. 園藝學報，2011，38(9)：1800-1806.

[34]賀立虎，李黔蜀. 食用菌遺傳育種技術的研究進展[J]. 陜西農業科學，2012，58(1)：116-118.

[35]趙厚坤，李云龍，劉 柱. 黑木耳雜交育種試驗[J]. 中國食用菌，2008，27(1)：19-21.