蒙藥達烏里芯芭組織培養快速繁育技術

韋坤華， 李旻輝， 徐建平， 朱 虹， 李林軒， 繆劍華， 高文遠

(1.天津大學藥物科學與技術學院，天津 300072； 2.廣西藥用植物園/廣西藥用資源保護與遺傳改良重點實驗室，廣西南寧 530023；3.內蒙古科技大學包頭醫學院，內蒙古包頭 014060)

達烏里芯芭(CymbariadahuricaL.)為玄參科芯芭屬植物，別稱大黃花、白蒿茶，是蒙醫專用藥芯芭的基源植物，蒙名為興安奈―哈吞―額布斯，達烏里芯芭屬于軸根型旱生植物，常生長于荒漠草原和山地草原，是草原上的主要植被，主要分布于內蒙古、黑龍江、河北等地。達烏里芯芭全株入藥，蒙藥名為韓琴色日高[1]，味微苦，性涼，具有祛風除濕、活血調經、散瘀止痛的功效，用于治療風濕關節炎、吐血、衄血、便血、外傷出血、腎炎水腫、黃水瘡等癥[2-3]。

目前，市場上的芯芭藥材主要來自野生資源，隨著其藥用價值的提高，市場對藥材的需求增大，導致達烏里芯芭被過渡采挖，野生資源蘊藏量也日趨減少，資源瀕臨枯竭。雖然近年來國內外對蒙藥的關注不斷增加，蒙藥芯芭也引起了諸多學者的重視，研究報道不斷增加，但主要集中在資源分布、定性鑒別、化學成分及藥理作用研究上[4-8]。到目前為止，針對芯芭的人工種植、種苗繁育技術的相關研究未見報道。達烏里芯芭一般通過種子進行繁殖，但在初步的種苗繁育工作中發現，達烏里芯芭的種子繁殖存在發芽率低、發芽不整齊、種苗質量不穩定等問題，嚴重制約了達烏里芯芭的規范化種植和生產。本研究以蒙藥芯芭的基源植物達烏里芯芭的種子為材料進行無菌苗的誘導，再通過正交試驗篩選最適合達烏里芯芭叢生芽快速繁殖與生根培養基，為達烏里芯芭種苗的快速繁殖和工廠化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

達烏里芯芭種子采于內蒙古自治區包頭市石拐區趙長城遺址附近山地，經內蒙古科技大學包頭醫學院藥學院生藥學教研室張春紅副教授鑒定該品種為達烏里芯芭CymbariadahuriaL.，經篩選后選用飽滿成熟的種子作為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 培養基成分及培養條件 本試驗以MS培養基為基本培養基，附加0.4%瓊脂，3.0%蔗糖，pH值調至5.8～6.0，在121 ℃的溫度下滅菌20 min，平均照度2 000 lx，光照時間12 h/d，培養溫度(25±3)℃。

2.2 外植體消毒

取飽滿的達烏里芯芭成熟種子，使用洗潔精溶液清洗干凈，洗凈洗潔精后置于紗布中，珠狀流水下沖洗15 min。在超凈工作臺上，用濾紙吸干水分后，加入0.1%HgCl2溶液消毒，設置6、8、10、12 min等4個時間梯度，消毒完畢后，棄去HgCl2溶液，用無菌水漂洗種子3次，再用無菌濾紙吸干水分，接種到初代誘導培養基上。

2.3 初代誘導培養及初步增殖

將消毒好的種子設去種皮和不去種皮2種處理，接種到添加了1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA的MS初代誘導培養基上，培養25～30 d誘導種子萌發。每種處理接種10瓶，每瓶接種2顆種子。

種子萌發后，將無菌萌發小苗頂芽切下繼續接種到添加了1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA的MS培養基上進行初步增殖，30 d轉接1次，繼代培養4～5代后獲得充足的試驗材料。

2.4 叢生芽增殖培養

采用3因素3水平的正交試驗設計L9(34)(表1)，將初步增殖材料接種到分別添加了6-BA、IAA、KT等3種激素的3個水平的增殖培養基上進行增殖培養，每個處理5瓶，每瓶接種5個芽，選取的芽大小長勢接近，30 d后測定試管苗平均生長率和芽增殖系數，并同時觀察記錄生長情況。

表1 正交試驗因素水平

2.5 生根培養

將增殖的健壯叢生芽接種到分別添加不同濃度的NAA(0.1、0.5、1.0 mg/L)、IAA(0.1、0.5、1.0 mg/L)的1/2MS生根培養基上進行生根培養，每個處理5瓶，每瓶3個單芽，30 d 后觀察并記錄生根情況，計算試管苗生根率。

2.6 數據處理

培養30 d后計算平均生長率、芽增殖系數和生根率。平均生長率=(材料質量-接種時材料質量)/接種時材料質量；平均芽增殖系數=(增殖后芽數-接種時材料數)/接種時材料數；生根率=增殖后生根芽數/接種時芽數。將所有生根苗生長狀況按大小分成5級，分別記為“+++++”“++++”“+++”“++”“+”。

3 結果與分析

3.1 不同的處理方法對種子萌發的影響

由表2可見，HgCl2消毒時間越長，消毒效果越好，污染率越低，不去皮和去處2種處理種子滅菌時間從6 min延長到12 mim時，污染率分別從75%和50%下降到30%和25%。但HgCl2消毒時間過長，易導致種子損傷甚至死亡。2組試驗的種子消毒 6 min 時萌發率分別為60%和70%，當消毒時間延長到 12 min 時的萌發率分別為30%和35%。結果也表明很多沒有完全消毒的種子也能萌發，消毒時間為6 min時，2種處理種子無菌萌發率分別為15%和30%，分別占本組萌發種子的25%與43%。綜合考慮消毒時間對種子的影響以及種子消毒效果，確定達烏里芯芭的消毒時間為8 min。

比較消毒后采取不同處理的2組種子的試驗結果，發現去種皮處理組的污染率較不去種皮低，此外去種皮處理可提高種子的萌發率和無菌萌發率。因此，消毒后進行剝去種皮處理可提高達烏里芯芭的種子消毒效果。

表2 不同處理對達烏里芯芭外植體滅菌效果的比較

3.2 不同激素配比對達烏里芯芭叢生芽增殖率的影響

將達烏里芯芭的無菌芽接種到表1正交試驗培養基中，培養30 d后測定平均生長率、芽增殖系數，并觀察芽的生長情況，結果見表3。

平均生長率結果(表4)表明，試驗的3種因素的各個濃度均能促進達烏里芯芭無菌苗的生長。無菌苗生長30 d后平均生長率在7.03～18.14之間。直觀分析結果發現，3種因素對達烏里芯芭平均生長率的影響順序為A(6-BA)>B(IAA)>C(KT)，且3種因素濃度的升高均有利于促進達烏里芯芭無菌苗的生長。達烏里芯芭的最佳繁殖培養基為A3B3C3，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.3 mg/L KT。芽增殖系數結果(表5)表明，3種因素的各個濃度均能促進達烏里芯芭芽增殖系數的提高。根據試驗結果，接種到繁殖培養基上培養30 d后的芽增殖系數在12.6～25.8之間，芽增殖系數最高的是8號培養基，為25.8。3種因素對達烏里芯芭芽增殖系數的影響順序為A(6-BA)>C(KT)>B(IAA)，且6-BA和IAA濃度的升高有利于促進芽增殖系數的提高，但KT對芽增殖系數的影響無明顯規律。達烏里芯芭最佳繁殖培養基為A3B3C1，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.1 mg/L KT。

比較分析發現，平均生長率的提高與芽增殖系數的提高并不完全同步，如9號培養基的平均生長率最高，達到18.14倍，但芽增殖系數為20.5，低于6、7、8號培養基的芽增殖系數。但在試驗過程中也發現，平均生長率較低的情況下，如果芽增殖系數過高，容易導致叢生芽細小、纖弱，容易出現玻璃化現象，不利于繼代培養，也不利于后續的生根移栽。因此，綜合考慮試驗結果，認為達烏里芯芭最佳的繁殖培養基以9號培養基A3B3C2為宜，即MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IAA+0.2 mg/L KT。

3.3 外源激素對達烏里芯芭生根的影響

生長健壯的叢生芽接種到生根培養基中培養30 d各處理生根情況見表6。達烏里芯芭在添加不同濃度NAA和IAA的1/2MS培養基上均可生根，且隨著NAA和IAA濃度的升高，生根率升高。比較2種激素的生根率結果發現，IAA更有利于達烏里芯芭試管苗的生根，培養基中添加NAA的最高生根率為83.33%，出現在NAA濃度為1.0 mg/L時；培養基中添加IAA的最高生根率為93.33%，同樣在IAA濃度為 1.0 mg/L 時。添加IAA培養基的試管苗較為健壯，根系較為發達，但添加NAA的培養基上培養材料的根系不發達，較為細長，且隨著NAA濃度升高出現愈傷組織，不利于后續的馴化移栽。因此，確定達烏里芯芭最佳生根培養基為1/2MS+1.0 mg/L IAA，在此培養基上獲得的試管苗植株健壯、根系發達且粗壯，移栽成活率較高。

表3 達烏里芯芭繁殖培養基篩選正交試驗結果

表4 達烏里芯芭繁殖培養基篩選平均生長率方差分析

表5 達烏里芯芭繁殖培養基芽增殖倍率方差分析

3.4 試管苗的移栽

根據達烏里芯芭的生長特性，將生根的健壯試管苗在室溫下開蓋煉苗3～4 d，再洗凈根部的培養基后，移栽到消過毒的沙床上，沙床隱蔽度約75%，每天早、中、晚各噴霧1次，30 d 后移栽成活率達98%。

4 討論

達烏里芯芭種子長卵形，長3.0～4.0 mm，寬2.0～2.5 mm，外種皮黃褐色，表面較光滑并具有光澤，質地較軟，但在顯微鏡下觀察，發現種子表面覆滿了蜂窩狀的小洞，這些特點導致種子消毒不徹底。本研究采用消毒后剝除種皮的方法對達烏里芯芭種子進行消毒，有利于提高消毒效率，這可能是因為隱藏在種皮內的微生物可能并未完全被殺死，而是在消毒液的影響下暫時失去活力，剝除種皮時也將大部分暫時失去活力的微生物與種子分離開來，從而提高了消毒效果，這一處理也可為有類似特性的種子消毒提供參考。

表6 不同培養基達烏里芯芭生根的影響

藥用植物組織培養是種苗繁育最為快捷有效的途徑，目前也有多種藥用植物實現了組培苗的工廠化生產，如金線蓮、白芨、番紅花、鐵皮石斛等[9]。本研究通過組織培養途徑繁殖達烏里芯芭叢生芽，芽的增殖系數達到16.3～25.8。但是在進行培養基篩選的取舍時，不能僅考慮芽增殖系數，還應結合實際的生產需要，綜合考慮芽的生長情況以及后續的生根移栽表現，從中篩選表現最佳的培養基才能節省生產成本，提高生產效率。因此，本研究所選出的達烏里芯芭最佳增殖培養基并不是芽增殖系數最高的培養基，而是芽增殖系數較高，叢生芽粗壯、長勢良好，適合生產使用的培養基。

[1]王鴻宇. 達烏里芯芭莖部化學成分的研究[D]. 呼和浩特：內蒙古大學，2015.

[2]國家中醫藥管理局中華本草編委會.中華本草·蒙藥卷[M]. 上海：上海科學技術出版社，2004：219-220.

[3]內蒙古自治區革命委員會衛生局.內蒙古中草藥[M]. 呼和浩特：內蒙古人民出版社，1972：374-375.

[4]趙一之. 芯芭屬(Cymbaria)植物種類考證及其植物區系分析[J]. 內蒙古大學學報，1999，30(3)：351-353.

[5]張春紅，姚 霞，哈斯巴特爾，等. 蒙藥芯芭的研究進展[J]. 中國現代中藥，2013，15(12)：1068-1072.

[6]Li Z H，Long P，Bai S R，et al. Chemical constituents fromCymbariadahuricaL. (Scrophulariaceae)[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2014，57：11-14.

[7]劉淑貞，趙俊萍. 芯芭的質量標準中薄層色譜鑒別研究[J]. 北方藥學，2011，8(12)：2-2.

[8]王振旺，董永和，鄔國棟，等. 蒙藥芯芭粉末及莖橫切片的顯微鑒別[J]. 包頭醫學院學報，2012，28(5)：7-8.

[9]陳文武，彭蘭華. 藥用植物的組織培養的應用[J]. 陜西農業科學，2006(5)：62-65.