低溫脅迫對雜交鵝掌楸幼苗活性氧和活性氮代謝的影響

成鐵龍， 彭 冶， 施季森， 陳金慧， 楊立明

(1.南方現代林業協同創新中心，江蘇南京 210037； 2.南京林業大學生物與環境學院，江蘇南京 210037；3. 南京林業大學林木遺傳與生物技術省部共建教育部重點實驗室，江蘇南京 210037)

鵝掌楸[Liriodendronchinense(Hemsl.)Sarg.]，別稱馬褂木，是我國南方地區重要的闊葉用材樹種，具有速生、材質優良、工業利用價值高等優點，而由中國馬褂木和北美鵝掌楸為親本經過人工雜交育成的種間雜種雜交鵝掌楸具有明顯的雜種優勢，樹干更通直，花葉更秀麗，生長更迅速，目前已成為我國南方地區人工林改造的替代樹種[1]。為了擴大雜交鵝掌楸的推廣應用范圍，特別是進一步在我國北方大面積推廣，開展雜交鵝掌楸應對低溫脅迫的生物學研究及其耐低溫育種研究具有重要意義。

植物低溫耐性是其抵御低溫危害的重要決定因素，低溫抗性的強弱是植物長期適應與進化的結果，并受遺傳因素的控制。但是不斷增加的研究結果表明，植物對冷害或凍害的耐受是一系列抗逆性相關基因或蛋白轉錄活化的結果[2]。研究發現，植物受到冷脅迫過程中，抗逆相關基因的轉錄與表達呈現一種網絡狀態。通過對含有24 000個擬南芥基因的芯片分析發現，低溫可以誘導其中655個基因表達，同時抑制284個基因的轉錄，表明低溫脅迫激活了植物體內基因表達的網絡系統，進而調控下游蛋白質和代謝物組分的代謝變化，從而表現出對低溫脅迫的耐受或敏感性[3]。

植物應答低溫脅迫的早期事件之一是氧化還原系統的變化，特別是活性氧代謝的失調導致的過量積累。過量積累的活性氧能改變植物體內正常的氧化還原狀態，進而引發氧化損傷，最后導致生物大分子的破壞以及植物葉片的細胞死亡[4-7]。植物防御系統能夠通過酶和非酶催化的抗氧化系統提供足夠的保護以消除正常條件下產生的活性氧損失[8]。前期的研究發現，抗氧化系統能夠被低溫誘導，如超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性的增加，然而植物體內產生的過量活性氧(ROS)可以破壞防御系統而導致氧化脅迫[8-10]。類似于ROS，一氧化氮(NO)也是一種氧化還原信號分子，能夠與ROS的一些分子發生反應[11]，這些反應的產物被稱為活性氮(RNS)。最近研究發現，低溫脅迫能誘導NO產生，并調控RNS相關物質的基因表達和酶活性[12]。已有報道顯示過氧化氫(H2O2)和NO在應答脅迫時具有協同效應，然而在低溫脅迫下植物體內活性氧和活性氮系統的變化特征尚不清楚。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選用的材料為筆者所在實驗室雜交鵝掌楸體細胞胚胎發生體系培養獲得的再生植株，基因型為1×5002。

1.2 低溫脅迫處理

選取在3/4 MS固體培養基中生長良好、高度為5～6 cm的雜交鵝掌楸體細胞胚胎再生植株幼苗，置于恒溫培養箱中進行4 ℃低溫處理，每2 d觀察植株表型并取葉片，處理時間分別為2、4、6 d。低溫脅迫6 d后于室溫恢復2 d，記為R2處理。每個處理時間點設45株植株。培養條件：溫度(4.0±0.5) ℃，光—暗周期為14 h—10 h，光照度350 μmol/(m2·s)，空氣濕度65%～70%。

1.3 生理指標的測定

1.3.1 酶活性測定 稱取1 g葉片，在液氮中充分碾磨，加入5 mL 50 mmol/L磷酸緩沖液[5 g/L PVP-40，0.1%(體積分數)TritonX-100，1 mmol/L EDTA (pH值為7.4)，蛋白酶抑制劑]于室溫下渦旋20 min，再于4 ℃、8 000g離心 20 min，取上清液用于酶活性的測定。SOD活性的測定參考Beauchamp等報道的方法[13]，CAT活性的測定參考Aebi報道的方法[14]。一氧化氮合成酶(NOS)活性測定使用NOS活性測試試劑盒(Cayman Chemical，Ann Arbor，MI，USA)，具體方法參考試劑盒的使用說明。稱取1 g葉片，在液氮中充分碾磨，加入酶提取試劑[100 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸(簡稱HEPES)-KOH(pH值為7.4)，1 mmol/L EDTA(pH值為7.4)，10% 丙三醇(體積分數)，5 mmol/L二硫蘇糖醇(DTT)，10 μmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)，0.1% Triton X-100(體積分數)，10 g/L PVP-40，20 μmol/L黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)]，于室溫下渦旋20 min，再于4 ℃、8 000g離心 20 min，取上清液用于NOS活性的測定，具體方法參照González等的報道[15]。

1.3.3 NO含量測定 切取12 mm2大小的葉片置于96孔板中，加10 μm DAF-FM 雙乙酸鹽[10 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.5)]暗室溫育10 min，用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH值為7.5)洗3次后，用熒光儀測定相對NO熒光強度[18-19]。

1.4 數據處理

用SPSS 16.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 低溫處理對雜交鵝掌楸幼苗表型的影響

低溫脅迫影響了鵝掌楸幼苗的形態。相對于室溫條件下，在低溫脅迫的1～2 d時間段，葉片有輕微的卷曲，隨著脅迫時間的延長，葉片卷曲較為明顯，特別是在低溫脅迫后 6 d，葉片呈現出較為明顯的卷曲，甚至部分植株幼苗出現了萎蔫。但低溫脅迫6 d后，解除低溫脅迫2 d，幼苗葉片基本恢復到與室溫類似的形態(圖1)。

2.2 低溫脅迫對鵝掌楸幼苗葉片活性氧和活性氮含量的影響

2.2.1 鵝掌楸幼苗葉片應答低溫過程中活性氧含量變化 超氧陰離子和過氧化氫是活性氧物質的2個重要成員，環境脅迫會誘導植物產生過量的活性氧物質的積累。研究發現，低溫脅迫引起鵝掌楸幼苗葉片超氧陰離子含量先緩慢升高后急劇升高。在低溫脅迫2 d時，鵝掌楸幼苗葉片超氧陰離子含量僅僅為對照植株的1.3倍；但當低溫脅迫處理4 d和6 d時，超氧陰離子含量分別增加到對照植株的4.8倍和6.6倍。低溫脅迫6 d后解除2 d，超氧陰離子含量有所降低，但仍處于較高的水平(圖2)。

同樣，低溫脅迫也導致鵝掌楸幼苗葉片內過氧化氫含量的增加，但與超氧陰離子含量增加趨勢有所不同。低溫脅迫2 d引起鵝掌楸幼苗葉片過氧化氫含量增加3.9倍，低溫脅迫處理4 d和6 d引起過氧化氫含量分別增加到對照植株的5.1倍和7.3倍。低溫脅迫6 d后解除2 d，過氧化氫含量仍為對照植物的3.7倍(圖3)。

2.2.2 鵝掌楸幼苗葉片應答低溫過程中一氧化氮含量變化 低溫脅迫引起了鵝掌楸幼苗葉片一氧化氮含量升高。在低溫脅迫2 d時，鵝掌楸幼苗葉片一氧化氮含量達到對照植株的2.2倍；但當低溫脅迫處理4 d和6 d時，一氧化氮含量分別增加到對照植株的3.7倍和4.8倍；低溫脅迫6 d后解除 2 d，一氧化氮含量略有降低，但仍是對照植株的3.4倍(圖4)。

2.3 低溫脅迫對鵝掌楸幼苗葉片活性氧和活性氮相關酶活性的影響

2.3.1 鵝掌楸幼苗葉片應答低溫過程中活性氧清除酶系的活性變化 通過測定植物體內2個關鍵的清除活性氧的酶SOD和CAT活性，可以了解二者在低溫脅迫過程中的防御作用。SOD是體內清除超氧陰離子的酶，可以將體內過量的超氧陰離子催化生成過氧化氫，進而分解成水，從而解除超氧陰離子過量積累造成的傷害。低溫處理鵝掌楸幼苗植株，引起葉片內SOD活性的增加，且隨著脅迫處理時間的延長酶活性逐漸升高(圖5)。與室溫條件相比，低溫脅迫處理2 d誘導SOD活性增加了1.6倍；脅迫處理4 d和6 d時SOD活性增加了2～3倍；當脅迫6 d后解除脅迫條件恢復到室溫2 d后，SOD活性降低到低溫脅迫處理4 d時的水平(圖5)。

CAT可以有效地將植物體內過氧化氫分解，維持機體內過氧化氫的動態水平。鵝掌楸幼苗植株在低溫脅迫下，CAT活性急劇升高，在低溫脅迫的2 d，CAT活性增加了2.8倍，隨著脅迫時間的延長，CAT活性緩慢升高。在脅迫6 d后恢復到室溫2 d后CAT活性又降低到低溫脅迫2 d時的水平(圖6)。

從上述結果可見，鵝掌楸幼苗葉片活性氧清除酶系SOD和CAT活性在應答低溫脅迫期間逐漸增強；相較于室溫生長條件下的對照植株，盡管解除低溫脅迫降低了SOD和CAT的活性，但它們在低溫脅迫后的植株內仍保持較高的水平。

2.3.2 鵝掌楸幼苗葉片應答低溫過程中一氧化氮合成酶的活性變化 NOS是催化一氧化氮合成的重要的酶。上述研究觀察到在鵝掌楸幼苗葉片中低溫誘導NO的快速增加，為了調查NOS對這一過程的作用，研究發現低溫脅迫誘導了NOS活性的增加。在脅迫處理的2、4、6 d，NOS活性分別增加了約40%、80%、110%，脅迫恢復后，NOS活性降低到對照植株NOS活性的1.6倍(圖7)。

3 結論與討論

在植物應答脅迫的早期階段活性氧能夠被誘導，并且被認為是植物體內傳遞脅迫信號的第二信使。但是當脅迫處理到一定程度時植物體內會產生過量的活性氧，并損傷植物體[20]。因此，調查脅迫狀態與活性氧積累的特征變化譜有助于了解植物應答脅迫的生理生化機制。研究發現，低溫脅迫下雜交鵝掌楸幼苗葉片內超氧陰離子自由基、過氧化氫等活性氧物質含量顯著增加，特別是隨著脅迫處理時間的延長，活性氧積累得更多。這可能是由于低溫脅迫打破了植株體內氧化還原系統的平衡狀態，使活性氧產生的速度超過了活性氧清除的速度，引起了活性氧含量的增加。為了避免植物體內由于活性氧積累造成的氧化傷害，植物擁有復雜的抗氧化系統來清除活性氧，其中SOD和CAT是2個主要的催化分解超氧陰離子自由基和過氧化氫的抗氧化酶，可以防止活性氧的過量積累。本研究中，低溫脅迫誘導了雜交鵝掌楸幼苗葉片內SOD、CAT活性的增強，SOD、CAT活性在低溫脅迫過程中增強可能是為了降低過量積累的活性氧對植物體的傷害。

低溫脅迫與活性氮代謝也密切相關[21]。研究發現，低溫脅迫也引起了雜交鵝掌楸幼苗葉片內一氧化氮含量的增加，該結果顯示一氧化氮參與到植物應答低溫脅迫的機制中；一氧化氮含量的應答變化趨勢與一氧化氮合成酶活性的增加呈正相關，由此暗示NOS活性也許被上調以便產生更多的一氧化氮來應答低溫脅迫。

已知活性氧和活性氮代謝是緊密相連且交叉反應的系統，活性氧和一氧化氮能直接相互作用生成過氧亞硝基陰離子等活性氮物質[22]。本研究中，低溫脅迫擾亂了活性氧和活性氮的平衡狀態，引起了活性氧和活性氮含量增加，而其自身防御系統調動了活性氧清除酶的活性以降低活性氧含量，以減緩其對植物體的氧化傷害(圖8)。

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