松嫩鹽堿草地2種優勢叢枝菌根真菌對紫花苜蓿耐鹽性的影響

王 娜， 陳 飛， 岳英男， 楊春雪

(東北林業大學園林學院，黑龍江哈爾濱 150040)

松嫩草地生態系統是以多年生草本植物為主要生產者的陸地生態系統，地處半濕潤半干旱過渡帶，是世界三大蘇打草原鹽堿地之一的松嫩鹽堿草地。目前，鹽堿地面積已超過370萬hm2，且以每年1.4%的速度擴展，松嫩草地生態系統正逐步走向衰老[1]。菌根是某些真菌侵染植物根部形成的共生體。菌根真菌菌絲由根部向土中伸展的長度遠大于根毛的長度，因此擴大了根對土壤養分吸收的范圍，而真菌則直接從植物中獲得碳水化合物，兩者互利互惠共同生活。叢枝菌根(Arbuscularmycorrhizae，簡稱AM)真菌是分布最廣泛、最普遍的一類土壤微生物，能與90%以上的植物根系形成菌根共生體[2]。研究發現，菌根真菌廣泛存在于鹽堿地中，幾乎所有的植物均具有菌根結構。菌根真菌不僅能夠增強植物在鹽堿土中的耐鹽堿能力和促進植物生長、發育，還能夠改善鹽堿土的土壤結構[3-4]。

紫花苜蓿(Medicagosativa)是豆科、苜蓿屬多年生草本植物，其株莖高挺、花色艷麗，常被作為園林背景材料廣泛應用。近年來，紫花苜蓿和AM真菌的共生體系逐漸受到研究者的關注，研究表明，紫花苜蓿能與多種AM真菌在自然條件下形成共生體系[4]。本試驗首先確定松嫩鹽堿草地上的優勢AM真菌菌種，并設置3種鹽脅迫水平(0、0.5%、1.0% NaCl)，研究在不同鹽脅迫水平下，優勢AM真菌對紫花苜蓿生長狀況的影響，并從植物生長和生理變化角度初步探討AM真菌提高羊草耐鹽性的作用機制，可為松嫩鹽堿草原退化生態系統的生物修復與重建提供科學的理論依據，同時擴大紫花苜蓿在有一定鹽度園林綠地中的應用范圍，對鹽堿地的綠化具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 鹽脅迫及接種菌劑試驗設計

試驗設3個鹽脅迫水平，分別為0、0.5%、1.0% NaCl；同一鹽脅迫水平下設4種接種處理：(1)每盆接種18 g滅菌的菌劑；(2)每盆接種18 g根內球囊霉(Glomusintraradices，簡稱GI)菌種；(3)每盆接種18 g地表球囊霉(Glomusversiforme，簡稱GV)菌種；(4)每盆接種18 g混合菌種(GI×GV，簡稱GIV)。共12個處理，每個處理重復6次。在東北林業大學光照培養室培養，溫度為20～25 ℃，光照時間為 08：00—18：00，共 10 h。其中，紫花苜蓿種子購于黑龍江省農業科學院研究所；菌劑均購于北京農林科學院植物營養與資源研究所國家基金資助“中國叢枝菌根真菌種質資源庫(簡稱BGC)”，其中GI是松嫩鹽堿草地的優勢菌種，GV是松嫩鹽堿草地的常見菌種[5]。

1.2 AM真菌侵染率的測定

播種30 d后，取部分新鮮紫花苜蓿根部樣品用于測定紫花苜蓿根系的菌根侵染情況。采用改良Phillips和Hayman染色法，用臺盼藍對根系進行染色，在MOTIC-BA400顯微鏡下鏡檢，計算菌根侵染率[6]。菌根侵染率=(侵染根段長/觀察根段長)×100%。

1.3 植物生理指標的測定

植物生理指標的測定參照《植物生理學實驗指導》[7]和《植物生理生化實驗原理和技術》[8]的方法進行。個體生物量采用電子天平稱質量法測定；葉綠素含量采用95%乙醇提取法測定；丙二醛(簡稱MDA)含量利用硫代巴比妥酸顯色法測定；細胞膜透性采相對電導率表示；蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定。

1.4 數據統計分析

采用SPSS 17.0軟件進行Duncan’s多重比較分析(P<0.05)；采用SigmaPlot 10.0對數據進行分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度的NaCl溶液處理下菌根侵染率的變化

由圖1可知，沒有接種AM真菌的紫花苜蓿(CK)菌根侵染率為0，而接種處理的紫花苜蓿菌根均有不同程度的侵染。接種的菌劑不同，紫花苜蓿菌根的侵染率也有所不同。隨著NaCl濃度的增加，相同菌劑接種時紫花苜宿的侵染率呈下降趨勢。同一NaCl濃度處理下，接種GIV紫花苜蓿菌根的侵染率最高，接種GV的次之，接種GI最低。接種GIV的紫花苜蓿菌根在0、0.5%、1.0% NaCl溶液處理下，侵染率分別為45.77%、41.20%、37.77%，顯著高于GV和GI菌劑同濃度NaCl溶液處理的菌根侵染率(P<0.05)。同一菌種在不同濃度NaCl處理下，菌根侵染率差異不顯著，說明NaCl脅迫對植株侵染率的影響不明顯。

2.2 不同濃度的NaCl溶液處理下個體生物量的變化

由圖2可知，同一NaCl濃度脅迫下，接種AM真菌能明顯減輕NaCl對紫花苜蓿個體生物量的脅迫，并表現出顯著性差異(P<0.05)。接種GIV菌種的紫花苜蓿個體生物量顯著高于不接種AM真菌植株的個體生物量(P<0.05)，顯著高于接種GI、GV菌種的植株的個體生物量。在0、0.5%、1.0% NaCl濃度下，接種GIV紫花苜蓿的個體生物量分別為2.30、1.86、1.33 g，比接種GV菌劑的紫花苜蓿的個體生物量分別高0.05、0.08、0.07 g，比接種GI菌劑的紫花苜蓿的個體生物量分別高0.16、0.27、0.21 g；紫花苜蓿個體生物量受NaCl溶液脅迫的影響較大，隨著NaCl濃度的增加，個體生物量明顯降低。

2.3 不同濃度的NaCl溶液處理下葉綠素含量的變化

葉綠體對鹽分脅迫的感知十分靈敏，由于外界鹽分過高，葉片水勢降低，葉綠素會隨之降解，從而抑制植物的生長和發育。由圖3可知，在沒有鹽脅迫時，接種GIV菌劑能顯著提高苜蓿中的葉綠素含量，達5.13 mg/g，比不接種菌劑、接種GI、GV分別高1.11、0.88、0.26 mg/g；隨著NaCl濃度的升高，接種與未接種的紫花苜蓿葉綠素含量均明顯降低；接種GIV和GV植株中的葉綠素含量顯著高于未接種植株(P<0.05)，且顯著高于GI接種處理(P<0.05)；在含鹽量為 0.5% 時，NaCl脅迫對紫花苜蓿葉綠素含量的影響表現出差異顯著性(P<0.05)。

2.4 不同濃度的NaCl處理下細胞膜透性的變化

用相對電導率來表示苜蓿葉片的細胞膜透性，相對電導率越高，說明苜蓿細胞膜透性越強，受鹽脅迫傷害越大。由圖4可知，同一鹽濃度下，接種AM真菌與不接種AM真菌的紫花苜蓿的相對電導率具有顯著性差異(P<0.05)；不同鹽濃度下，接種GIV和GV的相對電導率顯著低于對照的相對電導率(P<0.05)，在0、0.5%、1.0% NaCl濃度處理下接種GIV的相對電導率分別比對照的相對電導率降低 40.00%、39.11%、32.72%，接種GV分別比對照降低 32.91%、31.26%、28.66%。無論是否接種AM真菌，隨著鹽濃度的增加，紫花苜蓿均表現出相對電導率明顯增加的趨勢。

2.5 不同濃度的NaCl溶液處理下MDA含量的變化

MDA是反映膜質透性的重要指標，可反映細胞膜系統的損傷程度[9]。由圖5可知，隨著脅迫程度的加強，紫花苜蓿葉片的MDA含量明顯增高；在沒有NaCl脅迫的情況下，接種和未接種AM真菌的紫花苜蓿葉片中MDA的含量相差不大。在NaCl濃度為1.0%時，接種AM真菌能夠降低MDA的含量且與對照差異顯著(P<0.05)，接種GIV菌種MDA的含量為0.010 2 μmol/g，比接種GV和GI植株葉片的MDA含量分別降低 18.02%、31.23%，比未接種植株的MDA含量降低47.32%； 隨著鹽濃度的增加， 接種AM真菌的紫花苜蓿葉片中MDA含量增加的幅度明顯低于未接種植株葉片中MDA含量增加的幅度；隨著NaCl鹽脅迫程度的增強，AM真菌降低鹽脅迫下紫花苜蓿葉片中MDA含量越明顯。

3 結論與討論

侵染率是植物根系受AM真菌侵染程度的指標，同時也反映了AM真菌的侵染力，進而體現AM真菌與植物互惠共生的親和力程度。研究表明，逆境能夠抑制AM真菌的形成，隨著脅迫程度的加強，AM真菌的菌根侵染率隨之降低，在鹽脅迫下，AM真菌的菌根侵染率與NaCl含量表現為負相關關系，這是因為土壤中鹽分過多會抑制AM真菌孢子芽管的萌發，從而影響菌絲的形成[10-12]，本試驗的研究結果與之一致。楊海霞等研究表明，混合接種摩西球囊霉(Glomusmosseae)和GI菌劑的白三葉草比單一接種2種菌劑的侵染率高[13]，本試驗的研究結果與之一致。

試驗結果表明，相同NaCl水平下接種AM真菌對紫花苜蓿幼苗的生物量有明顯的促進作用，其中接種混合菌劑的紫花苜蓿的個體生物量顯著高于單一接種GV和GI菌劑的紫花苜蓿的個體生物量，這說明在鹽脅迫環境下混合菌劑與紫花苜蓿幼苗形成的菌根共生體更有利于抵抗鹽脅迫。植物生物量提高后向地下部分配，有利于提高紫花苜蓿根系對鹽脅迫的耐受力，從而提高紫花苜蓿的生存力，這一結果與馮固等的研究結果[14]一致。

許多研究表明，土壤中鹽濃度的增加會降低植物體內葉綠素的含量[15-16]。胡彥江等研究發現，接種摩西球囊霉的花生植株葉綠素含量明顯增加[17]，本試驗結果也表明與未接種AM真菌的紫花苜蓿相比，接種AM真菌的植株能明顯緩解鹽脅迫對葉綠素的傷害，提高紫花苜蓿體內葉綠素的含量(P<0.05)。鹽脅迫環境下，植物由于滲透作用導致細胞胞液外滲，使細胞外的電導率增大，因此，電導率是反映細胞膜受損狀況的直觀生理指標。本試驗中，接種AM真菌能顯著降低植物葉片的膜質透性(P<0.05)，緩解鹽脅迫所造成的生理影響，這一結果與Garg等的研究結果[18]一致。

MDA是膜脂過氧化的終產物之一，能夠反映細胞受脅迫的程度[19]。盛敏等研究表明，接種AM真菌植株葉片中的MDA含量低于未接種植株葉片中的MDA含量，可以緩解鹽脅迫對玉米的傷害，并提高玉米的耐鹽性[20]。試驗結果表明，隨著NaCl脅迫的增強，紫花苜蓿體內MDA的含量顯著升高，接種AM真菌的紫花苜蓿體內MDA含量的增幅較小，其中以接種混合菌劑的植株體內MDA含量的增幅最小，在NaCl濃度為1.0%時效果最明顯。這說明，混合接種能有效降低紫花苜蓿體內的MDA含量，降低植物細胞質膜受損害的程度，在一定程度上提高植物的耐鹽性。

紫花苜蓿在0、0.5%、1.0% NaCl脅迫處理后，生長發育明顯受到抑制，個體生物量隨脅迫程度的加強逐漸降低，接種AM真菌抑制了鹽脅迫對葉片、膜保護系統的傷害，降低了葉片的相對電導率和MDA的含量，促進了個體生物量的積累，增加了葉綠素含量。接種3種AM真菌的植株的菌根侵染率隨NaCl濃度的增加而下降，侵染能力表現為GIV>GV>GI，混合菌劑的接種效果明顯高于單一菌劑。此研究結果可為松嫩鹽堿草地退化生態系統的生物修復與重建提供科學的理論依據，同時擴大紫花苜蓿在有一定鹽度園林綠地中的應用范圍，對鹽堿地的綠化具有重要的意義。

[1]武羨慧，楊 進. 半干旱平原鹽堿區淺部地層基本物質成分的粒度結構與極化率的相關性研究[C]. 中國地球科學聯合學術年會，2014：1448-1449.

[2]袁維風，徐德聰. 叢枝菌根在植被恢復中的應用研究進展[J]. 廣東農業科學，2011(7)：161-163.

[3]Bonfim J A，Vasconcellos R L F，Gumiere T，et al. Diversity ofArbuscularmycorrhizalfungi in aBrazilianatlanticforest toposequence[J]. Microbial Ecology，2016，71(1)：164-177.

[4]宰學明，郝姍姍，邵志廣，等. 摩西球囊霉對NaCl脅迫下竹柳苗葉綠素含量和熒光參數的影響[J]. 江蘇農業科學，2013，41(8)：175-178.

[5]楊春雪，陳 飛，岳英男，等. 松嫩鹽堿草地26種植物根圍叢枝菌根真菌多樣性特征[J]. 草業科學，2015，32(12)：2008-2020.

[6]楊春雪，岳英男. 松嫩鹽堿草地土壤理化特性與叢枝菌根真菌侵染的相關性[J]. 草業科學，2014，31(8)：1437-1444.

[7]張志良，瞿偉菁. 植物生理學實驗指導[M]. 3版. 北京：高等教育出版社，2003：70.

[8]李合生. 植物生理生化實驗原理和技術[M]. 北京：高等教育出版社，2000.

[9]宋丹華，黃俊華，王 豐，等. 鈴鐺刺苗期對持續干旱脅迫的生理響應[J]. 江蘇農業科學，2016，44(5)：292-295，525.

[10]Yang Y H，Chen Y N，Li W H.Arbuscularmycorrhizalfungi infection in desert riparian forest and its environmental implications：a case study in the lower reach of Tarim River[J]. Progress in Natural Science，2008，18(8)：983-991.

[11]劉潤進，陳應龍. 菌根學[M]. 北京：科學出版社，2006：19-26.

[12]Selvakumar G，Krishnamoorthy R，Kim K，et al. Propagation technique ofArbuscularmycorrhizalfungi isolated from coastal reclamation land[J]. European Journal of Soil Biology，2016，74：39-44.

[13]楊海霞，李士美，李 敏，等. 叢枝菌根真菌對白三葉耐鹽性的影響[J]. 青島農業大學學報(自然科學版)，2014，31(2)：85-90.

[14]馮 固，張福瑣. 叢枝菌根真菌對棉花耐鹽性的影響研究[J]. 中國生態農業學報，2003，11(2)：21-24.

[15]Karimi G，Ghorbanli M，Heidari H，et al. The effects of NaCl on growth，water relations，osmolytes and ion content inKochiaprostrata[J]. Biologia Plantarum，2005，49(2)：301-304.

[16]Athar H，Zafar Z U，Ashraf M. Glycinebetaine improved photosynthesis in canola under salt stress：evaluation of chlorophyll fluorescence parameters as potential indicators[J]. Journal of Agronomy and Crop Science，2015，201(6)：428-442.

[17]胡彥江，楊德翠. 摩西球囊霉促進花生光合作用的機制[J]. 江蘇農業科學，2016，44(5)：145-148.

[18]Garg N，Bhandari P. Interactive effects of silicon andArbuscularmycorrhizain modulating ascorbate-glutathione cycle and antioxidant scavenging capacity in differentially salt-tolerantCicerarietinumL. genotypes subjected to long-term salinity[J]. Protoplasma，2016，253(5)：1325-1345.

[19]Siddiqui M H，Al‐Whaibi M H，Faisal M，et al. Nano‐silicon dioxide mitigates the adverse effects of salt stress onCucurbitapepoL.[J]. Environmental Toxicology and Chemistry，2014，33(11)：2429-2437.

[20]盛 敏，唐 明，張峰峰，等. 鹽脅迫下接種AM真菌對玉米耐鹽性的影響[J]. 西北植物學報，2011，31(2)：332-337.