嗜水氣單胞菌分離鑒定與藥敏試驗

王帥兵， 熊良偉， 朱善元，2， 徐建生， 吳海波， 王 婧， 張 龍

(1.江蘇農牧科技職業學院，江蘇泰州 225300； 2.江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，江蘇泰州 225300；3.揚州大學獸醫學院，江蘇揚州 225009)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是廣泛存在于水體中的一種正常共棲菌，有致病菌和非致病菌之分。致病性嗜水氣單胞菌是水生動物細菌性疾病的主要病原之一，可引起魚、蛙、鱉等水生動物出血性敗血癥[1]。近年來，該病在我國各地廣泛流行，大規模暴發，死亡率高，給水產養殖業造成巨大經濟損失。使用抗菌藥是目前防治水生動物細菌性疾病的主要手段。然而，大量研究證明，嗜水氣單胞菌已對多種藥物產生耐藥性[2-3]，給水生動物疾病防治帶來困難。

本試驗從江蘇、上海等不同地區疑似嗜水氣單胞菌病的水生動物采集病料，進行細菌分離，以嗜水氣單胞菌標準株為參照，經鑒定獲得4個不同來源的嗜水氣單胞菌，進行藥敏試驗并作比較分析，為有效防治嗜水氣單胞菌病、監控嗜水氣單胞菌的耐藥性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

細菌生化反應微量、營養瓊脂培養基、肉湯培養基、AHM鑒別培養基、5%兔血平板、1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨、藥敏紙片均購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 試驗用動物

異育銀鯽，約100 g/尾，購自江蘇省泰州市某水產養殖場，購回后在實驗室訓養、觀察1周無異常情況，備用。

1.3 病原菌的分離與純培養

無菌操作取疑似出血病的魚病灶組織(血液、肺、肝胰腺、腎臟等)，分別接種于普通瓊脂培養基，28 ℃培養24 h，分別挑取可疑菌落，涂片進行革蘭氏染色鏡檢。

挑取革蘭氏鏡檢為陰性短桿菌的疑似菌落在普通瓊脂培養基上多次劃線純化，直至得到形態一致、特征穩定的菌落。選取單個菌落轉接到瓊脂斜面28 ℃培養18 h，置4 ℃冰箱保存、編號備用。

1.4 革蘭氏染色及生理生化特性試驗

分離菌株及標準株分別連續單傳3代純培養后挑取單個菌落，進行革蘭氏染色鏡檢，穿刺接種AHM培養基及接種微量生化管，按常規方法進行AHM鑒別培養、氧化酶試驗及吲哚、甲基紅、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷等生化鑒定。

1.5 菌株的致病性鑒別

1.5.1 溶血試驗和溶蛋白試驗 取純培后的單個菌落分別劃線接種于5%無菌兔血平板和1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板，置28 ℃培養24 h后觀察溶血情況和溶蛋白情況。兔血平板上若在菌落周圍形成不透明的草綠色溶血環，認定為α溶血；若在菌落周圍形成清晰、完全透明的溶血環，則認定為β溶血；若菌落周圍無溶血現象，則認定為γ溶血。1%脫脂奶蔗糖胰蛋白胨平板若菌落周圍出現清晰、透明的溶蛋白圈，則認定為陽性，否則為陰性。

1.5.2 毒力因子提取與檢測 (1)Aer毒素的提取與檢測。各菌株接種到肉湯培養基后28 ℃培養48～60 h，4 500 r/min離心，取上清。參照文獻[4]的方法，先用20%飽和度硫酸銨在 4 ℃ 沉淀4 h，5 000 r/min離心后取上清，再用60%飽和度硫酸銨沉淀，4 ℃過夜，5 000 r/min離心，沉淀用50 mmol/L Tris-HCl(pH值為7.8～8.0)溶解后透析2 d，12 000 r/min離心 5 min，上清進行SDS-PAGE電泳。

(2)胞外蛋白酶(ECPase)的提取與檢測。各菌株分別用肉湯培養基于28 ℃培養48～60 h，4 500 r/min離心，取上清，參照文獻[5]的方法，用70%飽和度硫酸銨沉淀，4 ℃過夜，5 000 r/min 離心，沉淀用50 mmol/L Tris-HCl(pH值7.8～8.0)溶解并透析2 d，12 000 r/min離心5 min，上清進行 SDS-PAGE電泳。

1.5.3 回歸感染試驗 嗜水氣單胞菌接種于瓊脂平板，于28 ℃培養18～20 h，挑取單個菌落接種于瓊脂平板擴大培養18～24 h。無菌條件下向培養皿中加入少量無菌生理鹽水，用玻璃刮仔細刮下菌苔。離心，取沉淀用生理鹽水洗滌2次。用1 mL生理鹽水懸浮，分光光度法測菌液濃度后，用無菌肉湯培養基分別調整菌濃度至1×108CFU/mL。將2種濃度的菌液肌肉注射進行攻菌，劑量為1 mL/尾[6]，同時用無菌肉湯培養基作陰性對照。10尾魚/組，每天換水1/3，每3～4 h觀察并記錄死亡情況，對死亡魚進行解剖和病原再分離，以確定是否由攻毒活菌引起死亡。

1.6 藥敏試驗

按K-B藥敏紙片擴散法[7]進行操作，取單個菌落接種于肉湯培養基中，37 ℃培養16 h，調整菌濃度相當于0.5麥氏單位。用無菌棉拭子蘸取調整好的菌液于管壁擠去多余液體，均勻涂布于營養瓊脂平板，待培養基表面干燥后放置藥敏紙片使其緊貼培養基表面，各紙片的中心距離不小于24 mm，紙片距培養皿邊緣的距離不小于15 mm。于28 ℃培養24 h后，用游標卡尺量取抑菌圈直徑，根據杭州微生物試劑有限公司提供的標準判斷分離菌株對藥物敏感性。

2 結果

2.1 細菌形態觀察及AHM鑒別反應

標準株及4株分離菌在普通瓊脂培養基上于28 ℃培養24 h后生長良好，標準株及4個菌株菌落特征均為圓形、表面光滑、中央凸起、邊緣整齊、白色、不透明、大小約2 mm。在肉湯培養基中培養24 h后培養基明顯變渾濁，試管底部有乳白色沉淀，輕搖后乳白色沉淀均勻懸浮。取瓊脂培養基上的單個菌落分別進行革蘭氏染色后鏡檢均可見紅色、兩端鈍圓的短桿菌，判定為革蘭氏陰性桿菌。4株分離菌在AHM鑒定培養基上沿穿刺線呈刷狀生長(運動力為陽性)，培養基頂部顯紫色，底部為淡黃色，與嗜水氣單胞菌標準株特性一致。標準株及4株分離菌編號及來源見表1。

表1 5株分離菌的編號及來源

2.2 分離菌株生理生化特性

篩選出的4株分離菌吲哚、氧化酶試驗均呈陽性。葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、甘露糖、阿拉伯糖、七葉苷、水楊苷等糖發酵試驗均呈陽性，不能利用乳糖和鳥氨酸，與標準株反應一致，符合致病性嗜水氣單胞菌特性[8]。生理生化特性試驗結果見表2。

2.3 分離菌株致病性及毒力因子檢測結果

4個分離菌株與標準株溶血試驗均表現為β溶血，溶蛋白試驗均可見明顯的溶蛋白圈，表明分離菌及標準株均具致病性(表3)。

表2 生化試驗結果

注：“+”表示陽性反應，“-”表示陰性反應。

表3 5株分離菌的毒性試驗結果

提取毒力因子Aer毒素和ECPase，進行SDS-PAGE電泳后均可找到相應條帶，各菌株的Aer毒素約為45 ku，雜帶少；各菌株的ECPase約為35 ku，雜帶相對較多。SDS-PAGE電泳結果見圖1、圖2。

2.4 回歸試驗結果

試驗組鯽魚在接種感染后12 h表現出游動變緩、攝食減少或拒食現象，此后相繼出現體平衡能力減弱、廢食等現象，在接種后3～5 d開始出現明顯死亡，到7 d時死亡率均達60%以上，陰性對照組在試驗期內正常存活，未出現死亡(表4)。對感染死亡的魚進行分離培養、鏡檢、生化鑒定，結果與嗜水氣單胞菌特征一致。

2.5 藥敏試驗結果

4個菌株及標準株對14種抗菌藥物敏感性結果見表5。由表5可知，包括標準菌株在內的5個菌株對阿米卡星、左氧氟沙星和氟苯尼考均表現出高度敏感性；對氨芐西林、阿莫西林、紅霉素和四環素基本不敏感；5個菌株對阿奇霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環素、諾氟沙星、環丙沙星、 復方新諾明的敏感性表現不盡相同，對鏈霉素、慶大霉素總體表現敏感，對阿奇霉素、多西環素、諾氟沙星、環丙沙星、復方新諾明均表現出一定的耐藥性。

表4 分離菌株對健康鯽魚的感染試驗結果

表5 嗜水氣單胞菌對14種抗菌藥物的敏感性試驗結果

3 分析與討論

嗜水氣單胞菌有致病菌和非致病菌之分，致病菌可引起多種水生動物流行性傳染病的暴發，其致病性與毒力因子有關，目前已知的毒力因子主要有以Aer毒素為主的外毒素、胞外蛋白酶、結構蛋白和信號相關蛋白。Aer毒素是嗜水氣單胞菌引起變溫動物溶血和出血的主要毒力因子，常在胞外蛋白酶的協同下發揮致病作用[9]。因此，Aer毒素和ECPase成為鑒別致病性嗜水氣單胞菌的重要依據。本試驗通過提取5個菌株Aer毒素和ECPase并進行SDS-PAGE電泳，均可得到相應蛋白條帶。其中，45 ku是弱致病株Aer毒素的特征條帶，35 ku蛋白是胞外蛋白酶被2-巰基乙醇裂解后的產物[10]，為具有典型腸毒素性狀的細菌外毒素。這進一步證實4個分離菌株及標準株均為致病性嗜水氣單胞菌。

嗜水氣單胞菌引發的魚類出血病給水產養殖造成了巨大經濟損失。目前，使用抗菌藥物是防治魚類出血病的常用手段。藥敏試驗表明，嗜水氣單胞菌對阿米卡星、左氧氟沙星和氟苯尼考普遍敏感，在防治水生動物嗜水氣單胞菌感染疾病時可優先選用；對鏈霉素和慶大霉素總體表現敏感，可作為備選藥物。對阿奇霉素、多西環素、環丙沙星、諾氟沙星、復方新諾明部分菌株表現中度敏感，部分存在耐藥性，生產中應合理控制、科學使用。試驗中發現不同來源的嗜水氣單胞菌對氨芐西林、阿莫西林、紅霉素和四環素均產生耐藥性，與以往報道[11-12]基本一致，生產中應避免使用上述藥物。4個分離菌株及標準株對阿奇霉素、鏈霉素、慶大霉素、多西環素、環丙沙星、諾氟沙星、復方新諾明的敏感性結果存在差異，可能因養殖水域、養殖品種、用藥方法和用藥種類不同，導致嗜水氣單胞菌產生耐藥性的藥物種類也不同。防治嗜水氣單胞等引起的細菌性疾病時，應選用高度敏感的藥物，有效控制疾病，減少經濟損失。同時，嚴格按規定劑量用藥，注意交替用藥或輪換用藥，避免連續使用同一藥物或同類藥物，從而避免細菌產生耐藥性。此外，使用特異性卵黃抗體、中草藥對嗜水氣單胞菌感染也有一定防治效果[13-14]。

嗜水氣單胞菌是一種條件致病菌，一旦感染引發疾病則較難控制，因此重在預防。養殖前期應做好魚塘和魚種的消毒工作，養殖過程中應注意控制養殖密度，保持良好的水質，保證科學合理的餌料營養供給，發現病魚及時隔離和診斷。此外，使用高效的新型疫苗也是預防嗜水氣單胞菌感染的重要手段。然而，因水生動物給藥的特殊性及病原菌血清型的多樣化[15]，目前使用的菌苗不能獲得理想效果。因此，以細菌毒力因子為基礎開發可口服的亞單位疫苗是未來防治嗜水氣單胞菌感染的重要方向。

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