阿苯達(dá)唑及其亞砜在鯽魚(yú)體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及殘留消除

奚照壽， 袁華根， 丁麗軍

(江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇泰州 225300)

阿苯達(dá)唑(albendazole，簡(jiǎn)稱(chēng)ALB)為苯并咪唑類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥，廣泛用于畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖中體內(nèi)外寄生蟲(chóng)的防治。因此，有關(guān)阿苯達(dá)唑在食品動(dòng)物的藥動(dòng)學(xué)研究也較多，但大多集中于家畜體內(nèi)，國(guó)內(nèi)外對(duì)于阿苯達(dá)唑在魚(yú)體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)及殘留研究尚未見(jiàn)報(bào)道。由于缺乏應(yīng)用阿苯達(dá)唑防治魚(yú)類(lèi)寄生蟲(chóng)病的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)與資料，目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用阿苯達(dá)唑時(shí)，主要是參考該藥在畜禽上的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。本研究擬研究口服給藥后，阿苯達(dá)唑及其亞砜在鯽魚(yú)體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)，并通過(guò)多次給藥研究阿苯達(dá)唑在鯽魚(yú)肌肉中的殘留消除規(guī)律，以期為指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖中阿苯達(dá)唑的合理用藥及殘留監(jiān)控提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

體質(zhì)量(150±20)g/尾鯽魚(yú)，購(gòu)自某漁場(chǎng)。飼養(yǎng)于大小為2.2 m×1.9 m×0.8 m魚(yú)池中，使用經(jīng)曝氣的自來(lái)水，水深 0.3 m，每池30尾，每周投食3次。所有鯽魚(yú)試驗(yàn)前預(yù)養(yǎng)2周，試驗(yàn)期間不投食。

1.2 藥品與試劑

阿苯達(dá)唑?qū)φ掌?含量99.3%)、阿苯達(dá)唑原料藥(含量98.3%)，由常州亞邦齊暉醫(yī)藥化工有限公司提供；阿苯達(dá)唑亞砜對(duì)照品(含量99.5%)，由常州市亞邦獸藥有限公司提供。流動(dòng)相用乙腈、甲醇為HPLC級(jí)，樣品前處理乙腈、甲醇、乙酸乙酯等有機(jī)試劑為分析純。

1.3 儀器及其他

SHMADZU高效液相色譜儀(日本島津公司)；ODS-2HYPERSIL不銹鋼色譜柱(Thermo ELECTRON CORPORATION)；C18保護(hù)柱[翡納米(天津)科技發(fā)展有限公司]。

1.4 動(dòng)物給藥與采樣

1.4.1 口服給藥的藥動(dòng)學(xué) 水溫設(shè)定為15～18 ℃，將60尾鯽魚(yú)，隨機(jī)分為12組，每組5尾。每尾灌服阿苯達(dá)唑 12 mg/kg?？诜o藥后12、20、26、34、36、38、44、48、60、72、96 h 采集尾靜脈血約1 mL，分離血漿，-20 ℃保存。

1.4.2 口服給藥的殘留消除 40尾鯽魚(yú)于水溫(20±1)℃下，隨機(jī)分為8組，根據(jù)體質(zhì)量按12 mg/kg的劑量灌服給予阿苯達(dá)唑溶液，每天1次，連續(xù)5 d。于最后一次給藥后0.5、1、2、4、8、12、24 d各剖殺1組，取肌肉樣品，置于-20 ℃保存。

1.5 測(cè)定血漿阿苯達(dá)唑及其亞砜濃度

1.5.1 血漿樣品預(yù)處理 取血漿樣品0.25 mL于EP管中，加1 mL乙酸乙酯沉淀蛋白，渦旋混合3 min后，3 500 r/min離心15 min，吸取上清液于50 mL雞心瓶中，65 ℃旋轉(zhuǎn)蒸干，之后用0.5 mL流動(dòng)相溶解，渦旋混合2 min，轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管，高速離心5 min(16 000 r/min)，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，供HPLC分析。

1.5.2 HPLC測(cè)定條件 流動(dòng)相：體積比33 ∶67的乙腈-KH2PO4溶液(0.05 mol/L)；檢測(cè)器：紫外吸收檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：292 nm；柱溫：30 ℃；流速：1 mL/min；紫外檢測(cè)器靈敏度：0.020 AUFS；進(jìn)樣量：20 μL。在上述檢測(cè)條件下，在空白血漿樣品中添加系列濃度的阿苯達(dá)唑或其亞砜的標(biāo)準(zhǔn)工作液，經(jīng)預(yù)處理后分別測(cè)定血漿中阿苯達(dá)唑及其亞砜濃度，確定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及線(xiàn)性范圍、定量限(LOQ)與檢測(cè)限(LOD)、回收率、精密度。

1.6 測(cè)定組織中阿苯達(dá)唑及其亞砜的藥物濃度

1.6.1 組織樣品預(yù)處理 肌肉樣品剪碎后準(zhǔn)確稱(chēng)取2.5 g于50 mL離心管中，加入12 mL乙酸乙酯，渦旋混合3 min，勻漿2 min(15 000 r/min)，勻漿刀頭用12 mL乙酸乙酯清洗，且清洗液轉(zhuǎn)入勻漿液中，超聲提取10 min，3 500 r/min離心 10 min，將上清液轉(zhuǎn)入50 mL雞心瓶中，65 ℃蒸干。利用 2 mL 流動(dòng)相溶解雞心瓶中的殘?jiān)瑴u旋2 min，轉(zhuǎn)入10 mL玻璃離心管中，再用3 mL正己烷清洗雞心瓶，合并清洗液于玻璃離心管，渦旋3 min，離心5 min(4 000 r/min)，棄去正己烷層，再加入3 mL正己烷渦旋混合，離心，棄去正己烷層。將底層液體轉(zhuǎn)入另一離心管中，16 000 r/min離心5 min，0.45 μm濾膜過(guò)濾，供HPLC分析。

1.6.2 HPLC測(cè)定條件 流動(dòng)相：體積比3 ∶7的乙腈-KH2PO4溶液(0.05 mol/L，pH值3.5)；其余同“1.5.2”節(jié)。

1.7 數(shù)據(jù)分析處理

利用藥代動(dòng)力學(xué)軟件3P97處理鯽魚(yú)口服給藥后的血漿藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)以及肌肉藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，自動(dòng)擬合最佳藥動(dòng)學(xué)模型，推導(dǎo)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 鯽魚(yú)血漿及肌肉組織中阿苯達(dá)唑藥物濃度的HPLC檢測(cè)方法

所建立的色譜條件下，能較好地將阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑亞砜與血漿或肌肉組織中其他基質(zhì)組分完全分離開(kāi)。血漿中阿苯達(dá)唑及阿苯達(dá)唑亞砜出峰時(shí)間為21.10 min和4.00 min，峰形良好；肌肉中的保留時(shí)間分別為24.0 min和4.4 min，峰形對(duì)稱(chēng)，峰寬較窄。

基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)顯示，阿苯達(dá)唑在0.1～1.6 mg/L范圍內(nèi)，阿苯達(dá)唑亞砜在0.012 5～1.6 mg/L范圍內(nèi)，線(xiàn)性良好，相關(guān)系數(shù)大于0.999。

血漿中，阿苯達(dá)唑及其亞砜平均回收率介于82.93%～97.45%之間，變異系數(shù)分別為3.40%～3.70%和4.16%～4.53%，LOD分別為0.05、0.006 25 mg/L，LOQ分別為0.1、0.012 5 mg/L。肌肉組織中，阿苯達(dá)唑及其亞砜的回收率在82.39%～97.25%之間，變異系數(shù)分別為2.59%～5.26%、2.46%～4.36%，LOD分別為0.05、0.006 25 mg/kg，LOQ分別為0.1、0.012 5 mg/kg。

2.2 口服給藥的藥動(dòng)學(xué)特征

鯽魚(yú)口服阿苯達(dá)唑(12 mg/kg)后，血藥濃度時(shí)間數(shù)據(jù)可用一級(jí)吸收一室開(kāi)放模型擬合，血漿中阿苯達(dá)唑亞砜的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 鯽魚(yú)血漿中阿苯達(dá)唑亞砜的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)(單劑量口服阿苯達(dá)唑12 mg/kg)

2.3 口服給藥殘留消除結(jié)果

在(20±1)℃水溫下，鯽魚(yú)多劑量口服阿苯達(dá)唑(12 mg/kg)后，肌肉濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)可用一級(jí)吸收一室開(kāi)放模型擬合。肌肉中阿苯達(dá)唑亞砜的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表2。

表2 鯽魚(yú)多劑量口服阿苯達(dá)唑(12 mg/kg)后阿苯達(dá)唑亞砜的殘留參數(shù)

3 討論

3.1 檢測(cè)條件和樣品預(yù)處理方法的選擇

國(guó)內(nèi)外有關(guān)測(cè)定畜禽血漿中阿苯達(dá)唑及其代謝物的分析方法已有報(bào)道[1-4]。本試驗(yàn)在已報(bào)道方法的基礎(chǔ)上優(yōu)化了血漿及肌肉樣品預(yù)處理方法。本試驗(yàn)采用乙酸乙酯為提取液不但能夠?qū)悠分械牡鞍壮恋?，?duì)待測(cè)組分的提取效果也較好，而且乙酸乙酯對(duì)于操作人員安全無(wú)毒，樣品只需提取1次，提取的上清液澄清，易蒸干，提取過(guò)程較沙先誼等[2]和邱銀生等[3]的方法簡(jiǎn)單，靈敏度更高。HPLC結(jié)果顯示空白血漿樣品中雜峰少，干擾小，血漿中阿苯達(dá)唑亞砜保留時(shí)間與沙先誼等和邱銀生等的研究結(jié)果[2-3]基本一致，而阿苯達(dá)唑的保留時(shí)間與之相比則較晚，但藥物峰形好，拖尾因子小，可以滿(mǎn)足鯽魚(yú)血漿及肌肉組織中阿苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑亞砜藥物動(dòng)力學(xué)及藥物殘留研究的要求。肌肉樣品預(yù)處理方法與Casetta等[5]和林海丹等[6]的相比，過(guò)程簡(jiǎn)單，少量的乳化和不過(guò)小柱處理對(duì)出峰情況基本無(wú)影響，肌肉中阿苯達(dá)唑及其亞砜的回收率達(dá)到80%以上。肌肉中阿苯達(dá)唑及其亞砜檢測(cè)方法與邱銀生等和Fletouris等相比，空白樣品雜峰少、干擾小，阿苯達(dá)唑的保留時(shí)間較長(zhǎng)，但峰形較好。在該條件下，肌肉中阿苯達(dá)唑及其亞砜的回收率、檢測(cè)限、定量限及日內(nèi)、日間變異系數(shù)均可滿(mǎn)足鯽魚(yú)肌肉中阿苯達(dá)唑及其亞砜殘留分析的要求。

3.2 鯽魚(yú)口服給藥的藥動(dòng)學(xué)特征

阿苯達(dá)唑在動(dòng)物體內(nèi)代謝迅速，極少以原形藥物存在，主要代謝為阿苯達(dá)唑亞砜和阿苯達(dá)唑砜[7]。水溫條件為15～18 ℃時(shí)，鯽魚(yú)口服(12 mg/kg體質(zhì)量)阿苯達(dá)唑后，血漿中阿苯達(dá)唑亞砜的藥物濃度-時(shí)間變化規(guī)律符合一級(jí)吸收一室開(kāi)放模型，藥物吸收緩慢，藥物濃度低，代謝物消除亦較慢，表觀分布容積較小。與豬或羊單劑量?jī)?nèi)服阿苯達(dá)唑后的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)相比[1]，在本試驗(yàn)條件下，阿苯達(dá)唑亞砜在鯽魚(yú)的達(dá)峰時(shí)間比較長(zhǎng)，消除半衰期為11.9 h，長(zhǎng)于阿苯達(dá)唑亞砜在豬體內(nèi)的半衰期，但比在羊體內(nèi)的短。

3.3 殘留消除特點(diǎn)與休藥期

在(20±1) ℃水溫下，鯽魚(yú)以12 mg/kg體質(zhì)量的給藥劑量多劑量口服阿苯達(dá)唑，停藥后0.5～4 d內(nèi)阿苯達(dá)唑亞砜代謝物的生成速率大于消除速率，肌肉中的藥物濃度處于上升趨勢(shì)，4 d時(shí)達(dá)到峰濃度0.787 mg/kg，之后開(kāi)始下降，8 d時(shí)下降到0.064 mg/kg，24 d時(shí)藥物濃度低于檢測(cè)限。阿苯達(dá)唑在鯽魚(yú)口服給藥的殘留消除特征是，消除速率常數(shù)Ke為0.359 h-1，消除半衰期為1.971 d，停藥后24 d，藥物濃度低于檢測(cè)限。

魚(yú)類(lèi)動(dòng)物的體溫會(huì)隨著水溫的變化而變化，其采食量、新陳代謝也會(huì)隨著水溫的變化而改變，鯽魚(yú)最適合的生長(zhǎng)溫度在20～28 ℃之間，在非適性溫度條件下，其代謝強(qiáng)度明顯下降，進(jìn)而影響消除速率[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在最適生長(zhǎng)溫度范圍內(nèi)魚(yú)的體溫每增加1 ℃，藥物在魚(yú)體內(nèi)的代謝速率就增加10%[9]。藥物在魚(yú)體內(nèi)的消除速度隨水溫的降低而減慢，即藥物的半衰期會(huì)隨著水溫的降低而延長(zhǎng)[10]。

我國(guó)規(guī)定阿苯達(dá)唑在魚(yú)組織中的休藥期為500 ℃·d，本研究在(20±1) ℃水溫條件下，鯽魚(yú)多劑量口服給藥阿苯達(dá)唑(12 mg/kg體質(zhì)量)，連續(xù)用藥5 d，停藥后24 d阿苯達(dá)唑亞砜低于最低殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果與我國(guó)的休藥期相符合。但是對(duì)于其他種類(lèi)的魚(yú)來(lái)說(shuō)，還需要試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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