木瓜蛋白酶復合劑抑制淮山酶促褐變的應用

謝冬娣， 李丹梅， 龔振維

(賀州學院食品與生物工程學院，廣西賀州 542899)

鮮切果蔬保持了果蔬原有的新鮮狀態(tài)，又經(jīng)過了加工而使產(chǎn)品清潔衛(wèi)生，是滿足現(xiàn)代都市人快速生活節(jié)奏的一種果蔬加工方式。淮山(Yam)為薯蕷科薯蕷屬薯蕷的根莖，別稱懷山藥、淮山藥，是藥食同源的蔬菜。鮮切淮山在加工和貯藏中極易產(chǎn)生褐變，嚴重影響其外觀，不利于銷售。目前對鮮切淮山褐變的控制主要采用物理方法[1-4]，也常使用化學護色方法[5-7]，但有一定局限性，極少有使用生物酶法的報道。由于木瓜蛋白酶已經(jīng)被證實對抑制酶促褐變有顯著效果[6-8]，但目前卻尚未有將其用于抑制鮮切淮山褐變的研究。筆者將木瓜蛋白酶結合抗壞血酸(AA)、氯化鈉(NaCl)以及檸檬酸(CA)，以單一抑制劑對淮山褐變控制效果的研究為基礎，采用正交試驗優(yōu)化，研究安全環(huán)保的木瓜蛋白酶復合抑制劑對鮮切淮山酶促褐變的影響，以期探索生物酶法在淮山鮮切加工中的應用，為鮮切淮山加工貯藏生產(chǎn)實踐提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要藥品

主要材料：賀街淮山，為國家地理標志保護產(chǎn)品；保鮮袋；木瓜蛋白酶 (酶活性100萬U)。抗壞血酸、氯化鈉、檸檬酸、鄰苯二酚、H2O2、愈創(chuàng)木酚，以上藥品均為分析純。

1.2 試驗處理方法

挑選外皮完好、無病害、無機械損傷的淮山，切成厚度為3～4 mm的斜片[2]，然后用不同濃度的抑制劑浸泡處理1 h，晾干表面處理液后，平鋪裝入保鮮袋中，置于5 ℃冷藏庫貯藏。抗壞血酸濃度設為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。氯化鈉濃度設為0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%。檸檬酸濃度設為0.25%、0.30%、0.35%、0.40%、0.45%。木瓜蛋白酶濃度設為0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%。設不浸泡處理為對照組。試驗觀察貯藏期5 d，第5天檢測淮山的多酚氧化酶(PPO)活性、過氧化物酶(POD)活性、褐變度(BD)等指標。試驗設3個重復。

在單一抑制劑單因素試驗基礎上，篩選出抑制褐變效果明顯的3個因素及其濃度水平，進行正交試驗，確定各種抑制劑與木瓜蛋白酶的最佳組合。正交試驗各因素濃度水平設計見表1。

表1 各因素濃度水平

1.3 指標檢測方法

褐變度的測定：采用吸光度法，將樣品直接打碎，取適量樣品按體積比1 ∶10添加蒸餾水，低溫下勻漿2 min，過濾后取濾液于25 ℃保溫5 min，在波長410 nm處測定其吸光度，重復3次，以D410 nm×10表示褐變度。褐變度越高，表示褐變越嚴重。

多酚氧化酶活性測定：采用鄰苯二酚法[9]，以 1 min 內(nèi)吸光度變化0.01為1個酶活性單位，單位U/mL。過氧化物酶活性測定：采用愈創(chuàng)木酚法[9]，以1 min內(nèi)吸光度變化0.01為1個酶活性單位，U/mL。

2 結果與分析

2.1 檸檬酸抑制鮮切淮山酶促褐變效果

2.1.1 檸檬酸處理對淮山褐變度的影響 圖1顯示，在5 ℃的冷藏條件下，鮮切淮山經(jīng)過不同濃度檸檬酸處理，其褐變度BD值均低于對照組。其中，在0.25%～0.40%檸檬酸濃度范圍內(nèi)，隨著檸檬酸濃度增大，淮山的BD值一直呈現(xiàn)下降趨勢；檸檬酸濃度為0.40%時的BD值最低，與對照組差異最大；而在檸檬酸濃度為0.45%時淮山的BD值較高，但仍低于對照組。結果表明，檸檬酸處理濃度在0.40%時，對鮮切淮山的褐變抑制效果較好。

2.1.2 檸檬酸處理對淮山PPO、POD活性的影響 圖2顯示，鮮切淮山經(jīng)過不同濃度檸檬酸處理，其多酚氧化酶活性均明顯比對照組低，即表明檸檬酸能抑制鮮切淮山的PPO活性。原因可能是檸檬酸處理既調節(jié)反應體系pH值，又對PPO的輔基起到螯合作用[6]，從而抑制PPO活性。當檸檬酸濃度為0.30%～0.45%時，各處理組淮山PPO活性差異不明顯，其中0.35%濃度處理的淮山PPO活性最低，與0.25%濃度處理的差異較大。表明濃度為0.35%的檸檬酸抑制PPO活性效果比較明顯。圖2也顯示，在檸檬酸濃度試驗范圍內(nèi)，各處理組淮山的多酚氧化物酶活性均比對照組低，但不明顯；各處理組淮山POD活性差異也不明顯，即表明檸檬酸能較好地抑制鮮切淮山的PPO活性，但不能很好地抑制鮮切淮山的POD活性，這類似于李紅濤等研究的檸檬酸不能有效抑制淮山貯藏期間POD活性的結果[7]。

2.2 抗壞血酸抑制鮮切淮山酶促褐變效果

2.2.1 抗壞血酸處理對淮山褐變度的影響 從圖3可以看出，鮮切淮山經(jīng)不同濃度抗壞血酸處理，除濃度為0.3%的處理外，其余濃度的抗壞血酸溶液處理的淮山的褐變度(BD值)均比對照組的低。原因可能是因為抗壞血酸作為醌還原劑，阻止醌類物質進一步自發(fā)聚合形成色素物質[6]。其中，濃度為 0.10%、0.15%、0.20%抗壞血酸處理的BD值差異不明顯，而0.25%抗壞血酸處理的淮山的BD值最低，與對照組、0.30%處理組差異明顯，說明0.25%抗壞血酸對淮山褐變抑制效果較好。

2.2.2 抗壞血酸處理對淮山PPO、POD活性的影響 從圖4可以看出，不同濃度的抗壞血酸處理的鮮切淮山POD活性均比對照組的低。從0.10%濃度處理開始逐漸下降，到0.20%濃度處理降到最低點，之后，隨著抗壞血酸處理濃度的升高，淮山的POD活性逐漸升高。結果表明，在一定范圍內(nèi)，淮山POD活性隨著AA濃度增加而降低，之后隨著濃度增加而升高。其中0.20%抗壞血酸溶液對淮山POD活性抑制效果較好。經(jīng)過抗壞血酸處理的淮山的PPO活性也都比對照組的低，但是波動較大，在0.15%、0.20%濃度處理時分別達到最低、最高的PPO活性。這可能是由于抗壞血酸雖有金屬螯合作用，但是同時抗壞血酸也具有還原性、氧化性，能將氧化的醌還原為酚類物質而抑制褐變，但其本身比酚類物質更易于氧化褐變[7]。

2.3 木瓜蛋白酶抑制鮮切淮山酶促褐變效果

2.3.1 木瓜蛋白酶處理對淮山褐變度的影響 蛋白酶可導致一些促進褐變的酶系失活，從而抑制褐變的發(fā)生[6]。從圖5可以看出，經(jīng)不同濃度木瓜蛋白酶處理的淮山的BD值大部分比對照組的低，表明木瓜蛋白酶對于控制淮山的褐變度有一定的效果，但是在低濃度時效果不明顯，其中0.20%濃度的木瓜蛋白酶抑制淮山褐變的效果最明顯。

2.3.2 木瓜蛋白酶處理對淮山PPO、POD活性的影響 從圖6可以看出，經(jīng)過不同濃度木瓜蛋白酶處理的鮮切淮山的PPO、POD活性均比對照組的低。原因可能是由于木瓜蛋白酶與醌類物質偶聯(lián)中斷醌聚合，或與PPO、POD的輔基螯合而抑制了酶的活性[6]。在處理濃度0.10%～0.25%范圍內(nèi)，PPO、POD活性隨木瓜蛋白酶濃度增大而降低；在處理濃度在大于 0.25% 之后有升高的趨勢。結果表明，0.25%木瓜蛋白酶濃度處理對淮山PPO、POD活性的抑制效果較好。

2.4 氯化鈉抑制鮮切淮山酶促褐變效果

2.4.1 NaCl處理對淮山褐變度的影響 由圖7可以看出，在處理濃度0.5%～0.8%范圍內(nèi)，經(jīng)NaCl處理的鮮切淮山的BD值隨著NaCl溶液濃度的增加而逐漸升高，且大部分都高于對照組，表明NaCl溶液不能很好地保持淮山的感官特質，而且隨著濃度的增加，效果越來越差。

2.4.2 NaCl處理對淮山PPO、POD活性的影響 NaCl可以通過降低果蔬表面的氧溶解度而抑制PPO的氧化作用，亦或是使褐變酶發(fā)生鹽析作用，從而抑制褐變[1]。由圖8可以看出，經(jīng)過不同濃度NaCl處理的鮮切淮山的PPO活性基本上比對照組的低，在NaCl處理濃度為0.5%～0.8%范圍內(nèi)，鮮切淮山POD活性均比對照組的低，但差異均不明顯，其中 0.5% 濃度NaCl處理的淮山PPO活性最高，并且達到對照組水平；隨著處理濃度的升高，淮山PPO活性逐漸下降，但是下降緩慢。0.4%濃度處理的淮山POD活性最高，超過對照組水平。試驗結果表明，NaCl溶液對鮮切淮山的PPO、POD活性有一定的抑制作用，但是效果均不明顯。

2.5 復合因素處理抑制鮮切淮山褐變的結果與分析

根據(jù)“2.1”至“2.4”節(jié)的結果分析，檸檬酸、抗壞血酸和木瓜蛋白酶單一處理的鮮切淮山各項指標都比對照組的好，表明其抑制鮮切淮山褐變的效果比較好；而經(jīng)過NaCl溶液處理的鮮切淮山各項指標與對照組很接近，有些比對照組差。因此選擇檸檬酸、抗壞血酸和木瓜蛋白酶作為正交試驗的因素。

根據(jù)圖1至圖8的數(shù)據(jù)進行綜合分析，由于引起淮山褐變的酶主要是PPO，所以在用褐變抑制劑處理鮮切淮山時，以PPO活性作為首要指標來判斷各濃度抑制劑防褐變效果的強弱，以其他2項指標作為輔助指標，每個因素選擇3個濃度水平(表1)進行正交試驗。試驗的結果與分析分別見表2、表3。

從表3可以看出，在BD值、PPO活性、POD活性方面，A是主要因素；在BD值、PPO活性方面，C是次主要因素，B是次要因素；在POD活性方面，B是次主要因素，C是次要因素。綜合考慮可知，3個因素對3個指標影響的主次順序為A﹥C﹥B。因素A、因素C的水平按“少數(shù)服從多數(shù)”原則分別選擇A3、C2。因素B對3個指標的影響水平各不相同，難以選擇。因此，對組合A3B1C2、A3B2C2、A3B3C2進行驗證試驗。驗證結果中，A3B2C2組合(檸檬酸濃度0.40%、抗壞血酸濃度0.20%、木瓜蛋白酶濃度0.20%)最優(yōu)，獲得BD值0.194、PPO活性0.21 U/mL、POD活性9.2 U/mL的抑制褐變效果。

表2 復合抑制劑正交試驗結果

表3 復合抑制劑正交試驗結果分析

3 討論與結論

本試驗遵循降低酸度、金屬螯合作用、醌還原作用、醌偶聯(lián)作用等褐變控制機制，探討冷藏(5 ℃)條件下鮮切淮山酶促褐變的控制措施。有關研究表明，鮮切果蔬的褐變主要是酶促褐變，大多認為與酚類物質含量和PPO活性密不可分[1，10-11]，淮山多酚氧化酶的最適pH值=6.0[12]，那么降低介質中的pH值，可以控制酚酶的活性，抑制其催化作用。通常通過添加酸控制pH值使酚酶的活性喪失[6]。PPO、POD都是以金屬離子作為輔基的一種蛋白質，它能被金屬鰲合物所抑制。檸檬酸是良好的酸化劑，除了通過調節(jié)反應體系pH值來抑制褐變外，其結構中的3個羧基還可以對金屬離子起到較強的螯合作用[6]。而抗壞血酸既有金屬螯合作用，也可作為醌還原劑，從而清除自由基和活性氧，將氧化的醌還原為酚類物質[3]。木瓜蛋白酶屬于巰基蛋白酶，活性中心含半胱氨酸，可以作為醌類偶聯(lián)劑，能與醌類物質形成無色的復合物，從而中斷醌類物質聚合形成色素物質；同時木瓜蛋白酶可以通過與PPO、POD活性位點的金屬離子不可逆結合而抑制褐變相關酶的活性[6]。為了達到良好防褐變效果，單一抑制劑長期使用或者高濃度使用會帶來成本高、危害健康等問題。因此，多種抑制劑復合使用可起到協(xié)同增效作用，既可以避免以上問題，也可成為鮮切淮山加工及貯藏過程中的防褐控制方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，鮮切淮山極易褐變，與相關報道有相同的結論。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)單獨用檸檬酸或抗壞血酸處理鮮切淮山時，在PPO活性、POD活性這2個指標中，不同濃度影響酶活性強弱的順序差別較大。這可能是由于抗壞血酸雖然是一種PPO活性抑制劑，但作為抗氧化劑，它比酚類物質更易氧化褐變，故不宜單獨用于防止淮山褐變；而檸檬酸、植酸、氯化鈣等復合劑僅對PPO活性有抑制作用，在鮮切淮山貯藏期間還會使POD活性有所提高[7]。

綜上試驗結果表明，檸檬酸、抗壞血酸和木瓜蛋白酶抑制鮮切淮山的褐變具有較好的效果，而NaCl溶液對于防止鮮切淮山的褐變效果不明顯；采用檸檬酸、抗壞血酸和木瓜蛋白酶進行正交試驗所篩選的最佳抑制劑組合為0.40%檸檬酸+0.20%木瓜蛋白酶+0.20%抗壞血酸，各抑制劑作用主次順序為檸檬酸>木瓜蛋白酶>抗壞血酸。本試驗將木瓜蛋白酶用于鮮切淮山褐變控制是首例，其效果接近檸檬酸和抗壞血酸，優(yōu)于氯化鈉，說明其效果較好，值得推廣。

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