凍藏期間河蟹蟹黃蛋白質(zhì)和脂肪的氧化穩(wěn)定性

劉小莉， 張金振， 胡彥新， 劉 源， 周劍忠

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇南京 210014； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306)

河蟹營養(yǎng)豐富，味道鮮美，深受廣大消費(fèi)者的喜愛，特別是蟹黃中含有豐富的脂肪與蛋白質(zhì)，可用于制作各種美味菜肴。因此，近年來河蟹養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展迅速，成為特種水產(chǎn)品中最具代表性和最有影響力的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)[1]。

但河蟹的生產(chǎn)季節(jié)性非常強(qiáng)，有研究表明，蟹黃的風(fēng)味在10月份左右達(dá)到最佳，脂肪酸的含量在11月份左右達(dá)到最大值，具有最佳食用價(jià)值。在河蟹集中上市的季節(jié)，市場不能及時(shí)消化掉的大量的積壓鮮活蟹及殘次蟹一旦失去食用價(jià)值，也將造成很大的浪費(fèi)[2]。目前，國內(nèi)少數(shù)小型水產(chǎn)加工企業(yè)將鮮銷剩余的斷足螃蟹或小規(guī)格蟹經(jīng)洗凈、蒸煮，人工掏出蟹黃、蟹肉，包裝、速凍后出售。越來越多的研究表明，冷凍水產(chǎn)品的貨架期較長，可以有效抑制微生物和酶的作用，但即使在低溫下，水產(chǎn)類脂質(zhì)中含有的大量高度不飽和脂肪酸及蛋白質(zhì)也會(huì)發(fā)生氧化或分解變質(zhì)，改變水產(chǎn)品的組織、色澤、水合能力、風(fēng)味等一系列特性，對其保存、銷售和食用產(chǎn)生不良影響[3-4]。與蟹肉相比，蟹黃中含有更豐富的蛋白質(zhì)和脂肪，因此在冷凍儲(chǔ)藏過程中更易發(fā)生一系列影響品質(zhì)的生化特性的改變。

茶多酚作為一種天然抗氧化劑，具有天然、高效、低毒的特點(diǎn)，能有效抑制脂質(zhì)氧化，防止油脂哈敗，并能在一定程度上抑制蛋白質(zhì)的氧化變性，是化學(xué)合成抗氧化劑二丁基羥基甲苯(BHT)的有效替代物質(zhì)。本研究采用茶多酚作為抗氧化劑，并以BHT作為陽性對照，考察在凍藏期間蟹黃蛋白質(zhì)、脂肪氧化相關(guān)指標(biāo)的變化，篩選合適的抗氧化劑，以期為工業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐提供理論依據(jù)，提高凍藏產(chǎn)品的品質(zhì)，為蟹黃進(jìn)一步的加工利用提供原料保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料與試劑 鮮活河蟹，購自南京市玄武區(qū)孝陵衛(wèi)菜市場，體質(zhì)量(150±15)g，經(jīng)江蘇省淡水水產(chǎn)研究所鑒定為中華絨螯蟹(EriocheirsinensisH. Milne-Edwards)。

丙二醛(MDA)測定試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchonininc acid，BCA)法蛋白定量測試盒，均購自南京建成生物工程研究所；5，5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)[5，5-dithiobis(2-nitrobenzoic acid)，DTNB]、8-苯胺基-1-奈磺酸銨(1-anilino-napthalene-8-sulfonic acid，ANS)，均購自Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 低溫試驗(yàn)箱，購自南京泰斯特試驗(yàn)設(shè)備有限公司；醫(yī)用低溫保存箱，購自海爾集團(tuán)；多功能酶標(biāo)儀，購自美國BioTek儀器有限公司；高速勻漿機(jī)，購自德國IKA；pH計(jì)，購自上海雷磁儀器廠；蟹黃吸附機(jī)，購自山東省諸城市興和機(jī)械有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蟹黃采集和預(yù)處理 采用蟹黃吸附機(jī)通過真空吸附的方式采集新鮮河蟹的蟹黃，分別加入不同種類、不同終濃度的抗氧化劑。抗氧化劑包括終濃度為0.1、0.2 g/kg的BHT和終濃度為0.1、0.2、0.3、0.4 g/kg的茶多酚，另外以不添加任何抗氧化劑的蟹黃作為對照，-20 ℃速凍后凍藏待用。

1.2.2 蟹黃油脂的提取 稱取蟹黃樣品，4 ℃解凍。加入10倍體積的石油醚(沸程60～90 ℃)，超聲波處理40～60 min，靜置分層，收集上層有機(jī)溶劑相，下層水相樣品再加入石油醚重復(fù)提取2次，合并有機(jī)相，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干有機(jī)溶劑，得到蟹黃油脂粗提物。

1.2.3 過氧化值的測定 取“1.2.2”節(jié)中提取的蟹黃油脂粗提物，按照GB/T 5009.37—2003《食用植物油衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》[5]中過氧化值第二法測定過氧化值。

1.2.4 丙二醛含量的測定 稱取一定量的蟹黃樣品，加入5倍體積去離子水，10 000 r/min勻漿1 min，用于丙二醛含量的檢測。依據(jù)硫代巴比妥酸(TBA)法原理采用試劑盒檢測，結(jié)果以1 mg樣品蛋白質(zhì)中丙二醛的含量(nmol/mg)表示。

1.2.5 肌原纖維蛋白的提取 參照Yang等的方法[6]提取肌原纖維蛋白。向10 g蟹肉樣品中加入20 mL、4 ℃預(yù)冷的去離子水，12 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min、4 ℃離心 20 min，棄去上清液，沉淀中加入去離子水，再重復(fù)提取1次。沉淀中再加入20 mL、4 ℃預(yù)冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)(其中補(bǔ)充0.6 mol/L NaCl)，12 000 r/min勻漿30 s，10 000 r/min、4 ℃離心20 min，收集上清液。沉淀用上述含有NaCl的磷酸緩沖液再重復(fù)提取1次，合并上清液。蛋白質(zhì)含量采用BCA試劑盒測定。

1.2.6 總巰基含量的測定 參考Benjakul等的方法[7]測定總巰基的含量。調(diào)節(jié)“1.2.5”節(jié)中提取的肌原纖維蛋白溶液濃度至4 mg/mL，取0.5 mL加入4.5 mL 0.2 mol/L Tris-HCl buffer[pH值為6.8，含有8 mol/L尿素、2%十二烷基磺酸鈉(SDS)、10 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)]。取1 mL上述混合液，加入0.1 mL 0.1% DTNB，40 ℃溫育25 min，測定其D412 nm。空白對照以0.6 mol/L KCl溶液(pH值7.0)代替樣品。總巰基含量的計(jì)算公式如下：

總巰基含量(nmol/mg)=[(D×n)/(ε×ρ)]×106

式中：D為412 nm波長處的吸光度；n為稀釋倍數(shù)；ε為摩爾吸光系數(shù)，取值為13 600 L/(mol·cm)；ρ為蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.2.7 蛋白表面疏水性的測定 用ANS作為熒光探針測定表面疏水性[7]。用10 mmol/L磷酸緩沖液(pH值6.0，含 0.6 mol/L NaCl)將提取的肌原纖維蛋白溶液稀釋至不同濃度(0.125、0.250、0.500、1.000 mg/mL)，取4 mL各濃度的肌原纖維蛋白溶液，與30 μL ANS(用0.1 mol/L、pH值為7.0的磷酸鹽緩沖液溶解，濃度為8 mmol/L)混合。測定ANS-蛋白結(jié)合體的熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長374 nm、發(fā)射波長485 nm。以熒光強(qiáng)度對肌原纖維蛋白濃度做圖，所得到的曲線斜率即為蛋白表面疏水性指數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。采用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍藏期間蟹黃蛋白總巰基含量的變化

生物體內(nèi)蛋白質(zhì)巰基的含量非常豐富，且對氧化反應(yīng)比較敏感[8]。在凍藏加工過程中，由于凍結(jié)處理時(shí)冰晶的形成，以及儲(chǔ)藏期間溫度波動(dòng)造成的冰晶大小反復(fù)改變，使肌原纖維蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，使埋藏在分子內(nèi)部的疏基活性基團(tuán)暴露出來，進(jìn)而被氧化成二硫鍵，導(dǎo)致疏基含量減少。巰基的含量可以用于表征蛋白質(zhì)氧化的程度[9]。由圖1可知，6個(gè)月的凍藏期內(nèi)，各個(gè)處理的蟹黃中蛋白總巰基含量均呈減少趨勢，且2～3個(gè)月后下降幅度更大，其中對照組的下降趨勢最為明顯，添加抗氧化劑組的下降速度比對照組緩慢，且最終總巰基的含量均高于對照組。BHT抑制總巰基下降的作用顯著(P<0.05)，且所采用的2種不同濃度之間的作用差異不顯著。而添加茶多酚的4組樣品中，使用量為0.2、0.3、0.4 g/kg的處理效果顯著增強(qiáng)(P<0.05)，隨著使用量的增加變化不顯著，6個(gè)月儲(chǔ)藏期結(jié)束后，0.3、0.4 g/kg處理組的總巰基含量低于0.2 g/kg處理組。茶多酚是目前普遍使用的1種天然高效低毒的抗氧化物質(zhì)，是茶葉中多酚類物質(zhì)的總稱，其抗氧化機(jī)制主要有直接清除自由基、作用于與自由基有關(guān)的酶、絡(luò)合金屬離子、再生高效抗氧化劑等，可用于多種食品的保鮮儲(chǔ)藏[10-11]。本研究中茶多酚的抗氧化效果為非濃度依賴型，這可能是由于茶多酚在儲(chǔ)藏過程中發(fā)生自身氧化，其產(chǎn)物影響抗氧化的效果。

2.2 凍藏期間蟹黃蛋白表面疏水性指數(shù)的變化

蛋白質(zhì)表面疏水性可以反映蛋白質(zhì)的變性程度。蛋白質(zhì)溶解在水溶液中時(shí)，由于氨基酸殘基的極性不同，疏水作用力傾向于將疏水性氨基酸包裹于內(nèi)部，只有少量疏水性氨基酸能暴露于蛋白表面。在凍藏過程中，蛋白變性，其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，部分疏水殘基暴露，并隨著凍藏時(shí)間的延長及凍藏過程中溫度的波動(dòng)，疏水殘基暴露的數(shù)量增多，表面疏水性增大[12-13]。由圖2可知，BHT的作用效果表現(xiàn)出顯著的濃度依賴型，0.2 g/kg BHT抑制蟹黃蛋白表面疏水性指數(shù)增加的效果顯著高于0.1 g/kg BHT(P<0.05)。茶多酚的作用效果與濃度之間的依賴關(guān)系沒有BHT明顯，0.1 g/kg茶多酚的作用效果與0.1 g/kg BHT相當(dāng)，隨著濃度的增加，茶多酚對蛋白表面疏水性的抑制效果增強(qiáng)，0.3 g/kg茶多酚作用下蟹黃蛋白表面疏水性指數(shù)的增加幅度最小，但隨著茶多酚用量的繼續(xù)增加，蟹黃蛋白表面疏水性指數(shù)的增加趨勢反而增強(qiáng)。但即使在茶多酚的最佳作用條件下(0.3 g/kg茶多酚)，其作用效果也不及0.2 g/kg BHT。

2.3 凍藏期間蟹黃過氧化值的變化

河蟹蟹黃的脂含量較高，且與品種、喂養(yǎng)方式、溫度、氣候條件等因素密切相關(guān)，湯辰婧等測定了不同階段中華絨螯蟹的脂含量為6.85%～14.35%[14]。在長期的凍藏過程中，油脂也會(huì)發(fā)生緩慢的氧化[4]。油脂初始氧化的產(chǎn)物是過氧化物，過氧化物易分解產(chǎn)生醛、酮等小分子有害化合物，常以過氧化物在油脂中的產(chǎn)生作為油脂氧化酸敗的開端。

由圖3可知，2個(gè)月后蟹黃過氧化值(POV)迅速增加，與蛋白總巰基含量的變化趨勢類似。添加抗氧化劑處理對蟹黃POV增加的抑制作用顯著(P<0.05)，0.2 g/kg BHT的抑制效果最好，茶多酚在低濃度(0.1 g/kg)條件下作用效果不明顯，隨著濃度的增加，抑制作用顯著增強(qiáng)(P<0.05)，0.2 g/kg茶多酚與0.1 g/kg BHT對蟹黃POV增加的抑制作用相當(dāng)，0.3、0.4 g/kg 茶多酚對蟹黃POV增加的抑制作用效果顯著低于0.2 g/kg BHT(P<0.05)。在6個(gè)月凍藏期內(nèi)，各個(gè)處理組的蟹黃POV均低于9 meq/kg。武華等研究不同凍藏溫度對鳙魚片脂質(zhì)特性變化的影響，發(fā)現(xiàn)不同凍藏溫度下魚片的過氧化值均在第4周達(dá)到最大值，-10 ℃組的過氧化值最高達(dá)25.48 μmol/kg，-30 ℃組的過氧化值僅為 10.01 μmol/kg，而后隨著凍藏時(shí)間的延長，作為初級(jí)脂肪氧化產(chǎn)物的過氧化物逐漸降解[15]。不同研究中出現(xiàn)的POV不同變化趨勢與所測定樣品中飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸及其他組成有關(guān)。

2.4 凍藏期間蟹黃中丙二醛含量的變化

丙二醛是常用的脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合形成紅色產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰，測定值反映了脂肪二級(jí)氧化產(chǎn)物即最終生成物的含量[16]。由圖4可知，抗氧化劑的使用有效抑制了蟹黃中丙二醛的生成，對照組在凍藏3個(gè)月時(shí)MDA含量達(dá)到最大值，隨后又進(jìn)一步降解導(dǎo)致MDA含量下降。與蛋白質(zhì)氧化和過氧化值增加不同的是，0.2 g/kg茶多酚表現(xiàn)出最強(qiáng)的延緩丙二醛含量增加的作用，效果顯著優(yōu)于0.2 g/kg BHT(P<0.05)，隨著茶多酚使用量的進(jìn)一步提高，其延緩丙二醛含量增加的作用反而下降，與0.2 g/kg BHT的作用效果相當(dāng)。

3 結(jié)論

凍藏是水產(chǎn)品運(yùn)輸、儲(chǔ)藏中常見的方法之一。相對于其他保藏方式，凍藏能更大限度地保持產(chǎn)品的品質(zhì)，延長保質(zhì)期。但冷凍處理可以將水產(chǎn)品體內(nèi)大部分水分凍結(jié)成冰晶，體積增大，產(chǎn)生內(nèi)壓，且細(xì)胞介質(zhì)中離子強(qiáng)度增大，引起脂肪和蛋白質(zhì)的氧化，另外在長期凍藏過程中，由于溫度波動(dòng)，產(chǎn)品常常會(huì)經(jīng)過反復(fù)解凍、凍結(jié)的過程造成機(jī)械損傷，破壞肌肉結(jié)構(gòu)，加速蛋白和脂肪的氧化，造成其營養(yǎng)缺失、風(fēng)味劣變。

本試驗(yàn)通過對蟹黃進(jìn)行不同的抗氧化處理，測定每組樣品在凍藏過程中蛋白和脂肪氧化相關(guān)指標(biāo)的變化情況， 發(fā)現(xiàn)隨著凍藏時(shí)間的延長，蟹黃蛋白的總巰基含量呈下降趨勢，表面疏水性、過氧化值、丙二醛含量呈上升趨勢。抗氧化劑的使用對延緩上述蛋白質(zhì)和脂肪氧化指標(biāo)的變化有明顯的作用，且除丙二醛含量外，高濃度的BHT對其他蛋白質(zhì)和脂肪劣變指標(biāo)的變化表現(xiàn)出了較強(qiáng)的延緩作用。綜合而言，不同濃度的茶多酚中，0.2 g/kg茶多酚的使用量對各項(xiàng)指標(biāo)的變化均有較好的抑制效果，可代替人工合成抗氧化劑BHT，有效減緩凍藏過程中蟹黃蛋白和脂肪的氧化進(jìn)程。

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