棉油皂腳中棉酚的提取分析及鑒定

李文孝， 賈光鋒， 徐升運， 陳衛鋒， 張紅艷， 李忠玲

(1.陜西省科學院酶工程研究所，陜西西安 710600； 2.西安工業大學生物醫學工程系，陜西西安 710032；3.中科院西北生物農業中心，陜西西安 710600)

棉酚(gossypol)別稱棉籽醇或棉花毒素，是一種廣泛存在于錦葵科棉屬植物棉花的種子、葉莖及根部等器官中的多酚類化合物。棉酚按其存在的形式可分為游離棉酚和結合棉酚，兩者之和稱為總棉酚[1]。一般認為，結合棉酚不能被消化道吸收，游離棉酚能被消化道吸收，所以通常說的棉酚指的是游離棉酚。20世紀60年代，前蘇聯科學家發現棉酚具有抑制動物腫瘤細胞的作用[2]。現代醫學研究證明，棉酚除了具有抗腫瘤的生理功能，還具有抗生育[3]、抗瘧疾[4]、抗病毒[5]等多種生物學活性。由于棉酚的多個羥基極易被氧化變質，因此研究獲得高純度、性質相對穩定的棉酚已成為醫藥工業的熱點問題。本研究嘗試在超聲波的輔助下，采用有機溶劑法從棉油加工廢棄物-皂腳中提取、制備出純度較高，性質穩定，具有高附加值醫藥用的醋酸棉酚。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器

1.1.1 材料 棉油泥(陜西大荔偉恒生物科技有限公司)收集后冷凍保藏；醋酸棉酚標準品(純度≥99.8%，美國Sigma公司)；人前列腺癌細胞系PC-3，由美國密西根大學醫學院動物實驗中心提供。

1.1.2 試驗儀器 KQ3200DE超聲波清洗機；DU640紫外-可見分光光度計；AL104電子分析天平；RE-5002旋轉蒸發儀；PE2400元素分析儀；X-4數字顯微熔點測試儀；EQUINX55紅外光譜儀；AVANCF 300超導傅里葉數字核磁共振波譜儀；NUAIRE CO2細胞培養箱；美國BIO-RAD550酶標儀。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉酚的提取與測定

1.2.1.1 標準曲線 用三氯甲烷配制成濃度分別為5、10、15、20、25 μg/mL的醋酸棉酚標準品溶液，并以三氯甲烷為空白對照，在365 nm的紫外光下分別測定其吸光度。最后，以標準溶液濃度(C)為縱坐標，對應的吸光度(D)為橫坐標，繪制出標準曲線，得到的線性回歸方程為

C=27.715 0D+0.682 6；

式中：P<0.000 1，r2=0.997 2。

1.2.1.2 樣品中醋酸棉酚含量的測定 用三氯甲烷溶解醋酸棉酚粗品，配制成濃度為15 μg/mL的溶液，在365 nm處以三氯甲烷為空白測定吸光度，通過標準物質回歸方程計算樣品中的棉酚質量。以方程測算值與樣品質量的比值作為樣品中的醋酸棉酚含量。

1.2.1.3 棉油皂腳中棉酚的提取 稱量100 g棉油皂腳攪拌分散于100 mL鹽酸酸化的甲醇中，置于超聲波清洗機中常溫輻射一段時間；再加熱、離心分離、減壓濃縮，向濃縮液中加入其1/3體積的冰醋酸；再在超聲波清洗機中處理一段時間；然后，于陰暗處靜置3 h或更久一些時間，待出現黃綠色沉淀；最后，經減壓抽濾、石油醚洗滌、真空干燥得到醋酸棉酚粗品，稱其質量即為制備的醋酸棉酚粗品質量。再經過酸化丙酮溶液重結晶可以制備出高純度醋酸棉酚。

1.2.2 醋酸棉酚的分析鑒定

1.2.2.1 熔點測試[6]調整好顯微熔點測試儀，用毛細管取微量醋酸棉酚的重結晶品置于載玻片上，用蓋玻片壓實，于電爐上控溫加熱，在顯微鏡下仔細觀察晶體變化，并記錄晶體開始熔化和完全熔化時的溫度。

1.2.2.2 元素分析[7]利用PE2400元素分析儀測定醋酸棉酚重結晶品的碳(C)、氫(H)、氧(O)3種元素含量。

1.2.2.3 紫外光譜掃描[8]將醋酸棉酚的重結晶品和標準品溶于新蒸餾的三氯甲烷中，配制成濃度為15 μg/mL的溶液。以三氯甲烷為空白對照，在200～500 nm波長范圍內進行掃描。

1.2.2.4 紅外光譜分析[9]按照常規的溴化鉀壓片法測定醋酸棉酚重結晶品的紅外光譜圖。

1.2.2.5 核磁共振光譜分析[10]利用超導傅里葉數字核磁共振波譜儀測定醋酸棉酚重結晶品的核磁共振光譜圖。

1.2.4.6 抗腫瘤性能 根據Xu等的方法，用醋酸棉酚的重結晶品處理前列腺癌細胞系PC-3進行抗腫瘤試驗[11]。最終數據采用Prims 5.0軟件分析。

2 結果與分析

2.1 超聲萃取時間對醋酸棉酚產量和含量的影響

超聲波輔助萃取對提取物中醋酸棉酚的含量和產量隨著時間延長影響明顯。從圖1可見，從10～40 min棉酚的產量迅速增加達到最大值0.52 g，且提取物中醋酸棉酚含量逐漸提高至83.3%。可見，超聲波輔助下的最佳萃取時間為40 min。

2.2 酸濃度對醋酸棉酚產量和含量的影響

棉油堿煉時，棉酚和磷脂、多肽以及氨基酸等會發生化學反應形成性質相對穩定的Schiff’s化合物并隨皂腳一起沉降下來而被脫除。在酸性條件下，棉酚可以被重新釋放出來。由圖2可知，隨著酸濃度的提高，直到酸度達到1.4 mol/L時醋酸棉酚的產量和含量均迅速增加達到最大值0.54 g和 87.8%，繼續增加酸度棉酚產量和含量又出現緩慢下降。因此，1.4 mol/L是最佳的酸度控制點。

2.3 超聲結晶時間對棉酚產量和含量的影響

超聲結晶技術主要通過超聲波的空化效應，使已形成的晶體、固體顆粒及時分散，獲得較小的晶體顆粒，推動晶體生長，縮短結晶時間，控制晶體粒徑的分布，提高設備的生產能力和產品質量[12]。

由圖3可知，隨著超聲結晶時間延長，制備的醋酸棉酚產品質量、含量不斷增加。30 min時產品含量達最高值89.6%時，獲得0.63 g醋酸棉酚粗品，隨后隨時間延長，產品質量雖有小幅增加但含量卻下降明顯。通過試驗發現，超過30 min后產品中雜質含量增大對重結晶制備高純度產品會形成較大影響，所以選擇合適的超聲誘導結晶時間為20～30 min。

2.4 醋酸棉酚的結構與性能

2.4.1 熔點測試 通過本工藝生產的醋酸棉酚重結晶品經顯微熔點測定儀測定，其熔點為178～180 ℃，熔程窄、純度高，符合2015版《中國藥典》規定的藥用醋酸棉酚熔點為 175～180 ℃ 的要求，可以滿足藥物原料技術要求。

2.4.2 化學元素分析 將制取的重結晶醋酸棉酚樣品置于PE2400元素分析儀中進行測定，得到樣品中C、H、O等3種元素的含量(表1)。醋酸棉酚樣品中3種元素的測量值幾乎均與理論值一致，因此可以判斷提取的醋酸棉酚符合醋酸棉酚的分子式。

表1 醋酸棉酚C32H34O10元素分析結果

2.4.3 紫外光譜鑒定 使用紫外-可見吸收光譜法對有機化合物進行鑒別，主要依據有機化合物吸收光譜的形狀，吸收峰的數目，各吸收峰的波長位置、強度及相應的吸光度等。從圖4可知，醋酸棉酚樣品與標準品均在243、278、289、365 nm波長處有最大吸收度。另外，從紫外掃描圖譜中可以發現，365 nm處波形呈正態分布，與醋酸棉酚定量測定試驗中選擇365 nm作為最大吸收波一致，說明樣品與醋酸棉酚標準品可能為同一物質。

2.4.51H NMER結構分析 用三氯甲烷作溶劑，以四甲基硅烷為內標，獲得醋酸棉酚的核磁共振氫譜(圖6)。化學位移依次為標準品，1.56(d，12，J=6.56 Hz，12—CH3，12′—CH3，13—CH3，13′—CH3)，2.13(s，6，14—CH3，14′—CH3，2.34(s，3，13—CH3)，3.58(m，2，11—CH)，5.79(s，2，1—C—OH，1′—C—OH)，6.44(s，2，6—C—OH，6′—C—OH)，7.73(s，2，4—C—H，4′—C—H)，8.45(s，1，17—COOH)，11.15(s，2，15—CHO，15′—CHO)，15.21(s，2，7—C—OH，7′—C—OH)；樣品，1.56(d，12，J=6.56 Hz，12—CH3，12′—CH3，13—CH3，13′—CH3)，2.13(s，6，14—CH3，14′—CH3)，2.34(s，3，13—CH3)，3.57(m，2，11—CH)，5.73(s，2，1—C—OH1′—C—OH)，6.44(s，2，6—C—OH，6′—C—OH)，7.76(s，2，4—C—H，4′—C—H)，8.46(s，1，17—COOH)，11.15(s，2，15—CHO，15′—CHO)，15.22(s，2，7—C—OH，7′—C—OH)。醋酸棉酚標準品和醋酸棉酚重結晶品產生相同的磁響應信號，可以證明重結晶品具有標準品相近的純度，同時也證明了兩者為同一種物質。

2.4.6 抗腫瘤性能 為檢驗超聲波輔助溶劑法提取醋酸棉酚的生物活性，用重結晶醋酸棉酚品和標準品進行體外前列腺癌細胞PC-3培養試驗。在抑制腫瘤細胞時，醋酸棉酚重結晶品的半數抑制濃度(IC50)值略小于標準品，可以達到 8.01 μmol/L，說明該工藝提取的醋酸棉酚具有抗腫瘤生物活性。

3 結論與討論

利用超聲波輔助有機溶劑提取法從棉油加工廢棄物——皂腳中提取、制備出純度較高、性質穩定，具有藥用價值的醋酸棉酚，一方面可以實現變廢為寶，另一方面可有效提高棉籽加工業的附加值。利用熔點測定、元素分析、紫外掃描、紅外光譜分析、核磁共振光譜分析及抗腫瘤試驗，證明本工藝制備的醋酸棉酚重結晶品與標準品是同一物質，說明超聲波輔助下的有機溶劑提取醋酸棉酚工藝是可行的。

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