中性粒細胞胞外誘捕網在胰腺炎中的作用

邱秋 唐亮 劉凱軍 陳東風

急性胰腺炎(AP)和慢性胰腺炎(CP)是消化科基礎與臨床研究的熱點與難點，目前認為胰酶激活、白細胞招募、微循環灌注受損在AP的發病機制中發揮著重要作用，CP的發病機制涉及胰腺星形細胞激活、基因突變、免疫調節失衡等。中性粒細胞作為人體內最豐富的免疫細胞，除了傳統的抗菌作用外，近年發現它還以另一種方式即產生中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps, NETs)來調節炎癥、免疫和組織損傷。本文就NETs的產生、免疫作用和在胰腺炎發病機制中的作用做一綜述。

一、NETs的產生

NETs是以染色質為骨架的呈網狀結構的細胞外復合體，其上布滿組蛋白和多種顆粒蛋白如髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、中性粒細胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、組織蛋白酶G、抗菌肽LL-37等。IL-8、脂多糖及蛋白激酶C的激活劑丙二醇甲醚醋酸酯(phorbol myristate acetate, PMA)可激活中性粒細胞使其產生NETs。中性粒細胞產生和釋放NETs的過程被命名為NETosis。NETs協助中性粒細胞捕獲細菌、真菌或病毒，使其更有效地清除病原體。不能產生NETs的小鼠更容易被感染，進一步證明了NETs在抗感染中的重要作用。NETosis最初是指中性粒細胞在釋放NETs后裂解死亡即自殺式NETosis；后來發現病原體刺激中性粒細胞后可誘導另一種有活性的NETosis，即中性粒細胞釋放NETs后仍有完整的細胞膜，保持活性，繼續發揮噬菌功能[1]。PMA刺激中性粒細胞誘導自殺式NETosis的過程需數小時，而細菌等病原體誘導活性NETosis僅需數分鐘，此過程受血小板Toll樣受體2(Toll-like receptor 2, TLR2)和TLR4的調控。活性的NETosis比自殺式NETosis與感染的相關性更大，因為在感染狀態下中性粒細胞釋放NETs后仍保持活性，繼續發揮趨化、噬菌等功能[2]。并非所有的中性粒細胞都可產生NETs，當用IL-8、LPS或細菌刺激時，只有約20%的中性粒細胞產生NETs。中性粒細胞可能有不同的亞群，某些亞群具有促炎或抗炎功能，某些亞群具有修復功能，而炎癥條件下衰老的中性粒細胞產生NETs的概率較大[3]。

NETs的產生過程有3個重要酶：蛋白精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4, PAD4)、NE和MPO。鈣離子可激活PAD4[4]，PAD4催化組蛋白的精氨酸轉化為瓜氨酸，減少組蛋白所帶強陽性電荷，從而削弱組蛋白與DNA結合，促進染色質解聚，這是NETs在體內形成的基礎；染色質解聚后，核膜破裂，染色質釋放進入細胞質，在顆粒蛋白的修飾下釋放到細胞外，形成NETs[5]。即使在細菌等病原體激活物的刺激下，PAD4基因敲除的小鼠仍不能形成NETs[6]。因此，PAD4引起的組蛋白去電荷是體內NETs形成的先決條件。除了PAD4，NETs形成過程中需要NE將組蛋白分離出來，因此NE也是NETs形成必不可少的因素。NE屬于絲氨酸蛋白酶家族成員，由于帕皮永-勒菲弗綜合征(Papillon-Lefèvre syndrome, PLS)患者的中性粒細胞缺乏絲氨酸蛋白酶，因此在PMA刺激下其仍不能產生NETs[7]，這進一步支持NE在NETs形成中的作用。另外，MPO也是NETs形成的重要因素，MPO將過氧化氫轉化為次氯酸，次氯酸使組蛋白加氯，減少其正電荷，這種作用類似于組蛋白的瓜氨酸化，MPO還協助NE促進染色質解聚。但人中性粒細胞產生NETs依賴MPO，而MPO對于小鼠中性粒細胞產生NETs不是必需的[8]，這可能與小鼠和人中性粒細胞的細胞核形態不同有關，小鼠中性粒細胞有一個環狀的圓形核，這可能會影響組蛋白對次氯酸鹽的敏感性。

二、NETs的免疫作用

NETs是一種物理屏障，能夠限制病原體的播散和炎癥遞質擴散，避免對正常組織的破壞。NETs是重要的殺菌武器，依靠誘捕和直接殺滅病原體發揮抗菌作用，其能捕獲的病原體包括革蘭陽性和陰性細菌，如金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、結核桿菌及真菌如白色念珠菌等[9]。NETs能夠殺滅病原體與DNA、NE、抗菌肽等組分有關，DNA骨架上的磷酸二酯鍵使其具有高度殺菌功能，組蛋白瓜氨酸化后，DNA與組蛋白結合放松，而與細菌相互作用達到抗菌目的[10]。唾液酸化路易斯-X抗原刺激唾液中性粒細胞產生大量的NETs，嚴重的牙周病是由于伴放線放線桿菌等病菌感染，這些病菌能被NETs中的抗菌肽LL-37殺滅，故唾液可以預防牙周病或許與NETs有關。白塞病或反復阿弗他潰瘍患者的唾液不能產生NETs，這提示NETs對于維持口腔黏膜完整性有一定作用[11]。

Bianchi等[12]報道，1例慢性肉芽腫病合并曲霉菌感染的患者通過基因治療來恢復產生NETs的能力，可以清除曲霉菌的孢子和菌絲，從而治療肺曲霉菌感染，這被認為是NETs在免疫防御中具有重要作用的依據。近來，NETs在免疫防御中的作用受到研究者的質疑，原因是PAD4基因敲除的小鼠不能產生NETs，但這些小鼠并沒有表現出對于微生物感染免疫防御受損[13]；用盲腸結扎穿刺的方法建立腹膜炎模型，PAD4基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，盡管血循環中DNA和瓜氨酸化的組蛋白水平有顯著差異，但并無更高的發病率和死亡率[13]。因此目前的證據尚不能表明NETs在固有免疫防御中有著必不可少的作用，相反，NETs所含有的DNA、組蛋白和顆粒蛋白通常是自身抗體作用的靶點，與自身免疫性疾病的發生有關。如在抗中性粒細胞胞質抗體相關的血管炎中，針對MPO的自身抗體具有致病性；在系統性紅斑狼瘡中，循環中DNA抗體復合物沉積在腎臟、皮膚和關節，亦可造成病變[14]。系統性紅斑狼瘡的小鼠抑制PAD4減少了NETs形成后，可防止腎臟免疫復合物沉積、蛋白尿及血管病變[15]。因此，推測NETs在自身免疫反應中的作用比在固有免疫中更為重要。

三、NETs在AP中的作用

研究顯示NETs在AP的病理生理機制中發揮重要作用，它可通過多種途徑來促進胰腺組織損傷。首先，AP患者的血漿游離DNA(cell free-deoxyribonucleic acid, cf-DNA)水平明顯升高[16]；在牛磺膽酸鈉誘導的急性壞死性胰腺炎(ANP)小鼠模型，胰腺組織中有大量NETs和組蛋白沉積，且血漿中cf-DNA水平升高，清除中性粒細胞可顯著減少胰腺組織中NETs沉積和降低血漿cf-DNA水平。脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonuclease Ⅰ, DNase Ⅰ)可使NETs中的DNA骨架解聚，從而破壞NETs的結構。SAP小鼠在給予DNase Ⅰ后胰腺組織中組蛋白表達水平下降、胰腺水腫程度明顯減輕、血淀粉酶水平亦有所下降[16]。由于NETs中的蛋白質近70%為組蛋白，而組蛋白可損傷上皮和內皮細胞，甚至可致細胞死亡[17]，因此組蛋白可能是NETs導致胰腺組織損傷的原因之一。其次，ANP小鼠胰腺組織的MPO活性增高、血管外中性粒細胞數量增加，給予DNase Ⅰ后MPO活性下降、中性粒細胞數量減少，提示NETs可調節中性粒細胞招募，促進胰腺組織損傷，該過程與NETs上調趨化因子CXCL2和巨噬細胞1抗原的表達有關。再者，用NETs與胰腺腺泡細胞共培養發現，NETs可促進胰酶激活，且水平與雨蛙肽誘導的胰酶激活水平相當，DNase I可抵消NETs誘導的胰酶激活[16]。NETs促進胰酶激活可能有3方面原因：第一，NETs可顯著增加胰腺腺泡細胞內信號轉導及轉錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription 3, STAT3)活性，此主要依賴組蛋白提高STAT3磷酸化水平，而STAT3是腺泡細胞內的重要信號分子，故NETs可能通過STAT3誘導胰酶激活；第二，基質金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase-9, MMP-9)是胰腺腺泡細胞胰酶激活的有效誘導劑[18]，抑制NETs生成可降低血漿MMP-9水平，故NETs可能是通過MMP-9來促進胰酶激活；第三，NETs中的其他蛋白成分如酶和抗菌肽等也可能參與了腺泡細胞胰酶激活。因此，與血管炎、關節炎等非感染性疾病一樣，AP時NETs對機體的作用似乎是有害的，靶向作用于NETs可能是改善SAP炎癥的有效方法。

SAP時機體釋放大量的促炎癥細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6等損傷血管內皮細胞，激活內、外源性凝血途徑，導致高凝狀態，使靜脈血栓或動脈栓塞形成的風險增加[19]。NETs可促進血栓形成，McDonald等[20]建立敗血癥小鼠模型證實NETs中網羅了大量聚集的血小板、激活的凝血酶和纖維蛋白凝塊，可檢測到組織因子表達；利用DNase I去除NETs，可使血管內凝血酶活性顯著下降、血小板聚集減少、微血管通透性改善。該研究還證明，NETs誘導的血管內凝血是微血管低灌注的基礎，抑制NETs可減輕血管內凝血和器官損傷。NETs誘導血栓形成的原因是多方面的，首先，NETs為血栓形成提供支架[21]；其次，NETs的組分參與了凝血因子的激活，NETs結合并激活Ⅻ因子，啟動內源性凝血途徑；NETs中的NE能夠降解組織因子途徑抑制物、促進Xa活化，NE和組織蛋白酶G通過蛋白酶激活受體激活血小板，組蛋白可上調組織因子、激活血小板、減少蛋白C活化，中和NETs內的組蛋白H4可顯著減輕血管內凝血和微血管功能障礙[9,21]。因此，NETs是連接炎癥和血栓之間的橋梁，SAP時機體處于重度炎癥狀態，推測NETs在SAP高凝狀態的發病機制中可能發揮了重要作用。

四、NETs在CP中的作用

CP的危險因素分類可概括為TIGAR-O(toxic-metabolic, idiopathic, genetic autoimmune, recurrent severe, obstructive)，即毒性代謝產物、特發性、遺傳性、自身免疫性、復發性AP和SAP、梗阻性。其組織病理學特點是慢性炎癥、間質纖維化、實質重塑，病理改變可能呈局灶性分布，病變周圍的外分泌組織仍可保持正常。胰管堵塞是CP的原因之一，其可導致胰腺局部炎癥，堵塞時間長短決定了胰腺炎的嚴重程度。AP時胰腺組織炎癥部位有大量中性粒細胞浸潤，隨著組織纖維化，中性粒細胞浸潤相對減少，在胰腺導管內和導管周圍粒細胞聚集體是2型自身免疫性胰腺炎的標志性改變。NETs對自身免疫性胰腺炎也至關重要，研究顯示IgG4相關的自身免疫性胰腺炎患者的血漿NETs水平較健康對照組高，患者的胰腺組織中有NETs沉積，且NETs激活漿細胞樣樹突狀細胞使其分泌大量TNF-α是引起自身免疫性胰腺炎的主要原因[22]。

McAllister等[23]研究發現，Th17細胞分泌的IL-17A在胰腺惡性腫瘤之前的炎癥階段有促炎和促癌作用。IL-17A本身的生物學作用較弱，但可增強TNF-α、IL-1β、IL-6的生物學作用。向小鼠尾靜脈注入帶有IL-17A的載體，小鼠并未出現血淀粉酶、脂肪酶升高等AP的特征，反而出現體重下降等慢性消耗性疾病的表現，注入載體后10 d胰腺組織中性粒細胞浸潤明顯，之后逐漸減少，到28 d時出現明顯的胰腺纖維化和結構重塑，胰腺組織TNF-α、IL-1β、IL-6表達水平升高，而其他器官如脾臟等只有少量中性粒細胞浸潤，病理改變不明顯[24]。雨蛙素誘導胰腺炎模型的原理是其細胞毒性，因此雨蛙素誘導的胰腺炎胰膽管內未發現NETs聚集體。IL-17A誘導CP原理與雨蛙素不同，IL-17A可促進粒細胞生成和遷移，中性粒細胞被趨化進入胰膽管管腔內，在胰液刺激下形成NETs聚集體。10例胰腺良性腫瘤和10例惡性腫瘤相關性胰腺炎患者的胰液標本中分別有4例和6例可檢測到NETs聚集體，而3例胰管擴張和胰腺假性囊腫患者的胰液標本中均可檢測到NETs聚集體[24]。NETs聚集體降低胰腺導管所分泌的胰液的流動性，進而胰管堵塞，在堵塞部位，NETs中的絲氨酸蛋白酶使胰蛋白酶原過早激活，啟動胰腺自身消化，腺泡破壞，從而促進胰腺局灶性炎癥和實質重塑，這個過程依賴PAD4，PAD4是NETs聚集體形成的關鍵，PAD4基因敲除可減緩CP疾病進展[24]。具體來說，是胰液中某些成分如碳酸氫根離子和碳酸鈣晶體刺激中性粒細胞誘導NETs形成。由此推測，減少胰液中碳酸氫根離子和碳酸鈣晶體成分可減少NETs形成或許是治療CP的有效手段。

總之，NETs除了抗菌作用外，還在自身免疫性疾病中有重要作用。對于AP，NETs可誘導胰酶激活、加重胰腺組織損傷，促進血栓形成，與SAP的高凝狀態有關。對于CP，NETs聚集體堵塞胰管，促進胰腺局灶性炎癥和實質重塑。因此，NETs對于AP和CP的疾病進展均發揮重要的作用，如果能抑制NETs產生，或許能控制胰腺炎疾病進展，有利于臨床治療。