高原低氧環境下大鼠急性壞死性胰腺炎相關性肺損傷p38MAPK的表達

韓彥舟 朱海宏 郭亞民

重癥急性胰腺炎(SAP)患者常伴有不可控制的全身炎癥反應以及多器官功能障礙，其中以急性肺損傷最為突出，超過 50%的SAP 患者會出現嚴重的肺部并發癥，稱為SAP相關性肺損傷(SAP associated lung injury,SAP-ALI)，為SAP患者病死率高的主要原因[1-2]。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)屬于MAPK家族中應激活化的蛋白激酶，主要介導應激、炎癥等信號，在機體炎癥反應調控過程中起著極其重要作用。有研究報道p38MAPK活化及過度表達可能是導致SAP-ALI的重要因素[3]。高原地區缺氧、低氣壓、紫外線強，更增加了SAP患者許多不確定因素[4]。本研究觀察不同海拔及不同時間點牛磺膽酸鈉誘導的急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠p38MAPK表達變化及其與SAP-ALI的關系，為高原低氧環境下SAP-ALI的診療提供參考。

一、材料與方法

1．動物分組及模型制備：SPF級健康雄性Wistar大鼠320只，3～4月齡，體重(200±20)g，由甘肅中醫學院實驗動物中心提供(許可證號：SCXK2004-0006)。大鼠以專用飼料喂養(北京科奧協力飼料有限公司提供)，自由攝食和飲水。按數字表法將大鼠隨機分成西安組(海拔400米)、西寧組(海拔2 300米)、興海組(海拔3 300米)、溫泉組(海拔4 500米)，每組80只。適應性飼養20 d后再隨機分為假手術組及ANP 1、6、12、24 h組，每組16只。采用胰頭、胰體以及胰尾部多點緩慢注射5%牛黃膽酸鈉1 ml/kg體重方法建立大鼠ANP模型。假手術組打開腹腔翻動胰腺數次后關腹。假手術組于造模后6 h處死，其他各時間組分別在造模后1、6、12、24 h處死[5]，取胰腺及肺組織，液氮冷凍后置-80℃保存。

2．胰腺、肺組織p38MAPK mRNA表達檢測：取凍存的胰腺及肺組織各100 mg，應用Trizol試劑提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說明書逆轉錄cDNA，再以cDNA為模板，按照SYBR Premix EX Taq試劑盒說明書進行定量PCR擴增。p38MAPK正義引物序列為5′-TCCAAGGGCTACACCAAATC-3′，反義引物序列為5′-TGTTCCAGGTAAGGGTGAGC-3′；內參β-actin正義引物序列為5′-GAGAGGGAAATCGTGCGTGAC-3′，反義引物序列為5′-CATCTGCTGGAAGGTGGACA-3′。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，圖像分析儀掃描，以目的條帶與內參條帶灰度值比作為mRNA 相對表達量。

3．胰腺、肺組織p38MAPK蛋白表達檢測：取凍存的胰腺及肺組織各100 mg，應用RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法定量后常規行蛋白質印跡法檢測p38MAPK蛋白，以β-actin為內參。兔抗大鼠磷酸化p38MAPK一抗工作濃度為1∶80，ECL液顯影。應用Image J軟件獲取條帶灰度值，以目的條帶與內參條帶灰度值比作為蛋白相對表達量。實驗重復3次，取均值。

二、結果

1．各組大鼠胰腺、肺組織p38MAPK mRNA表達量比較：在相同海拔下，胰腺及肺組織p38MAPK mRNA相對表達量隨造模時間延長而顯著增加，且各時間點組間的差異均有統計學意義(P值均<0.05)；除假手術組外，不同海拔條件下大鼠胰腺及肺組織p38MAPK mRNA相對表達量隨海拔的升高而顯著增加，且各時間點組間的差異均有統計學意義(P值均<0.05，表1)。

2．各組大鼠胰腺、肺組織p38MAPK蛋白表達量比較：在相同海拔下，胰腺及肺組織中p38MAPK蛋白相對表達量隨造模時間的延長而顯著增加，且各時間點組間的差異均有統計學意義(P值均<0.05)；除假手術組外，不同海拔條件下各組大鼠胰腺及肺組織p38MAPK蛋白相對表達量隨海拔的升高而顯著增加，且各時間點組間的差異均有統計學意義(P值均<0.05，表2，圖1)。

討論高原氣候的主要特點是低氣壓、低氧分壓、寒冷、干旱、多風、輻射強和溫差大，大氣壓和氧分壓隨著海拔高度的增加而逐級降低[6]。在這種惡劣的環境條件下，一旦發生胰腺炎，由于肺臟對血氧含量變化特別敏感，更容易引起肺損傷的發生[7]。高原環境下出現低氧血癥、呼吸窘迫、肺毛細血管通透性改變等是高原地區AP患者肺損傷共同的病理生理基礎和臨床特征[8]，因此明確SAP-LI的發病機制迫在眉睫。

表1 各組大鼠胰腺組織、肺組織p38MAPK mRNA的表達

注：與假手術組比較，aP<0.05；與同海拔1 h組比較，bP<0.05；與同海拔6 h組比較，cP<0.05；與同海拔12 h組比較，dP<0.05

表2 各組大鼠胰腺組織、肺組織p38MAPK蛋白的表達

注：與假手術組比較，aP<0.05;與同海拔1 h組比較,bP<0.05；與同海拔6 h組比較,cP<0.05;與同海拔12 h組比較,dP<0.05

圖1 西安組(1)、西寧組(2)、興海組(3)、溫泉組(4) ANP 1 h大鼠胰腺(上)、肺組織(下)p38MAPK蛋白的表達

MAPK包括4種亞型，其中p38MAPK是1993年Brester等發現的由360個氨基酸組成的蛋白，在機體應激、缺氧、炎癥反應調控過程中具有極其重要的作用[9]，被認為是多條信號途徑的交匯點和共同通道。研究發現SAP引發的成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)及多器官組織功能障礙等并發癥的發生與多種細胞因子及炎性遞質的作用有關[10]。劉君等[11]發現p38MAPK信號轉導通路與SAP-ALI有著密切的關系；Werner等[12]研究證明，SAP-ALI與肺組織內大量中性粒細胞積聚、活化、產生大量的促炎因子有關，活化的中性粒細胞在介導AP肺損傷中起關健作用；Chen等[13]研究表明，抑制ANP大鼠p38 MAPK的活化，可減少其炎癥細胞因子TNF-α、IL-1β釋放，從而改善ANP的炎癥反應，降低SAP-ALI發生率。

本研究結果顯示，造模后ANP可引起大鼠急性肺損傷，同時伴有p38MAPK活性及基因表達水平顯著增加，且其增加與海拔的升高呈正相關，這種變化貫穿于SAP-ALI發病的整個過程，表明p38MAPK信號轉導通路對SAP-ALI的發生、發展具有重要意義。