遠志總皂苷對癲癇模型大鼠nAChRɑ7亞基表達的影響

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癲癇是由多種原因導致的腦部神經元高度同步化異常放電所致的臨床綜合征。癲癇的核心內容是癲癇發(fā)作，但30%～40%的癲癇病人除癲癇癥狀外，常伴有學習記憶減退，注意力分散等認知功能障礙表現[1]。迄今為止，癲癇對認知功能影響的機制仍未完全闡明，且缺乏有效的防治藥物。膽堿能神經系統與注意力、學習和記憶等認知過程有關[2]。煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)廣泛分布在海馬、前額皮質等與認知功能密切相關的區(qū)域。煙堿型乙酰膽堿受體ɑ7(nAChRɑ7)是nAChR的一種重要亞型，廣泛存在于中樞神經系統，可能在認知過程中發(fā)揮重要作用[3]。

遠志是我國傳統的安神益智良藥，其中的遠志總皂苷(Tenuigenin，TEN)被認為是其有效成分，在提高學習記憶方面有顯著的作用，可通過降低膽堿酯酶活性，保護中樞膽堿能系統改善學習記憶[4-5]。前期實驗證實TEN可改善癲癇模型大鼠空間學習記憶能力及海馬LTP的抑制[6]。本實驗在前期實驗基礎上觀察大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基表達的變化及TEN對其影響，探討TEN改善學習記憶功能的部分可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 成年雄性Wistar大鼠，體重250 g～300 g，來源于北京海淀興旺動物養(yǎng)殖場，室溫(25.5±2)℃喂養(yǎng)。

1.1.2 藥品、試劑及實驗儀器 遠志總皂苷(Tenuigenin，TEN)，純度為72%，在山西大學中醫(yī)藥現代研究中心提取，取37.5 g溶于1 L的蒸餾水中，充分溶解后置于4℃環(huán)境保存；戊四氮(Pentylenetetrazole，PTZ)購于Sigma公司，將其溶于生理鹽水配成1%的溶液(10 mg/mL)后置于4℃環(huán)境保存；SABC免疫組化染色試劑盒(羊抗兔IgG，SABC液，5%BSA封閉液)購于武漢博士德生物工程有限公司；兔抗大鼠nAChRɑ7購于北京博奧森公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及造模 將32只雄性Wister大鼠隨機分為對照組(8只)、模型組(12只)、TEN防治組(12只)。模型組每天腹腔注射致驚厥劑量的PTZ(40 mg/kg)，注射完觀察大鼠2 h，記錄發(fā)作分級、次數，根據大鼠體重進行劑量調節(jié)，連續(xù)給藥28 d，停藥7 d，再以相同劑量點燃，驚厥發(fā)作以Racine法分級標準進行判斷，以連續(xù)2次以上、5級以上發(fā)作視為造模成功。TEN防治組在造模的同時灌服TEN溶液(375 mg/kg)，連續(xù)給藥35 d，然后腹腔注射PTZ點燃。對照組則灌服等劑量的生理鹽水。造模結果：對照組8只大鼠均存活；癲癇模型組12只大鼠癲癇發(fā)作死亡3只，未達標1只，造模成功8只；TEN防治組大鼠癲癇發(fā)作死亡2只，未達標1只，造模成功9只。

1.2.2 切片制備 采用7% 水合氯醛(3 mL/kg)進行腹腔麻醉，剪開胸腹腔，暴露心臟和肝臟，剪開左心尖及右心耳部，將導管插入左心室并固定，快速注入約250 mL生理鹽水至肝臟完全變白，右心耳流出澄清液體后，再注入40 g/L 多聚甲醛固定液數分鐘，待大鼠肝臟變硬、肢體僵直后斷頭，取出完整鼠腦并投入含4%的多聚甲醛中4℃固定(4～6) h，脫水，透明，石蠟包埋。冠狀位連續(xù)切片，切片厚度為2 μm。

1.2.3 免疫組化染色 采用SABC(Strept Actividin-Biotin Complex)免疫組化染色法。①石蠟切片常規(guī)脫蠟；②PBS洗2 min×2 次，3% 的H2O2溶液，室溫10 min；③PBS洗2 min×2 次，加入枸櫞酸緩沖液中于高壓鍋中煮沸2 min，冷卻至室溫；④PBS洗2 min×2次，滴加5% BSA 封閉液，室溫30 min，甩去多余液體；⑤滴加稀釋的兔抗大鼠nAChRɑ7稀釋液(1∶50)，4 ℃ 過夜；⑥ 復溫40 min，PBS 沖洗2 min×2次；⑦滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 30 min，PBS洗2 min×2次；⑧滴加SABC，37℃ 20 min，PBS 洗2 min×3 次；⑨ DAB 顯色，(7～8) min后蒸餾水終止顯色反應；⑩蘇木素復染11 s。脫水，封片。光鏡下觀察。

1.2.4 陰性對照的建立 以10% PBS 代替一抗，其余步驟同前。

1.2.5 灰度值測定 應用美國aperio公司Scanscope數字病理掃描系統，400倍物鏡下，在相對應的海馬CA1區(qū)內，隨機各取5個視野，測單個視野中nAChRɑ7的灰度值。

2 結 果

各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基免疫組化結果見圖1，免疫染色陽性物質主要存在于神經元細胞表面。其中對照組細胞密集、免疫染色深；模型組細胞稀疏、免疫染色淡，其平均灰度值顯著大于對照組(P<0.05)；TEN防治組免疫染色陽性細胞較密集，染色較深，其平均灰度值顯著小于模型組(P<0.05)。詳見表1。

圖1 各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達免疫組化結果

表1 各組海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達的平均灰度值(±s)

3 討 論

癲癇后繼發(fā)認知功能損害的現象已逐漸引起廣泛重視，但目前癲癇對認知功能影響的機制仍未完全闡明，且缺乏有效的防治藥物。膽堿能假說認為膽堿能突觸是一種記憶突觸，與學習記憶過程密切相關[7]，乙酰膽堿釋放減少或乙酰膽堿受體數目減少會導致認知功能障礙。煙堿型乙酰膽堿受體ɑ7(nAChRα7)是煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)的重要亞型之一，由5個相同的α7亞基構成，屬于配體門控離子通道，廣泛分布于海馬、下丘腦、皮質下基底核等部位，可能在認知過程中發(fā)揮重要作用[3， 8]。研究表明缺乏nAChRα7的小鼠存在認知能力減退[9]，而使用煙堿或其他nAChRα7激動劑可改善認知功能，改善學習、記憶功能[10]。

遠志在臨床上的應用歷史悠久，具有改善認知能力的功效，TEN作為其主要成分，對學習記憶影響也日益受到重視[10]。TEN可改善癲癇模型大鼠空間學習記憶能力及海馬LTP的抑制[6]。本實驗在此基礎上觀察大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7亞基表達的變化及TEN對其影響，結果提示TEN能夠提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)nAChRɑ7表達。TEN可顯著提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)NMDA 受體的表達[11]。

TEN可改善癲癇模型大鼠空間學習記憶能力及海馬LTP的抑制，其可能是通過提高癲癇模型大鼠海馬CA1區(qū)NMDA受體和nAChRɑ7的表達起到改善癲癇模型大鼠認知障礙的作用，該系列研究結果為臨床研制新藥提供了理論依據。

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