線粒體融合、分裂與心肌缺血再灌注損傷的研究進展

許美芬+梁玲芝+趙磊+陳賢君

[摘要]線粒體是真核細胞中一種高度動態變化的細胞器，這種網絡結構的動態平衡受線粒體融合蛋白1/2（Mfn1/2），視神經萎縮蛋白1（OPA1）和動力相關蛋白1（Drp1）的調節，并對線粒體的結構和功能有著重要的作用。心肌細胞因其高耗能性而富含線粒體，線粒體融合、分裂的動態平衡在心肌細胞的能量代謝過程中起著關鍵的作用。目前的研究普遍認為，心肌細胞能量代謝障礙是心肌缺血再灌注損傷的始發環節。因此，由線粒體融合、分裂異常引起的功能障礙與心肌缺血再灌注損傷密切相關。

[關鍵詞]線粒體；融合與分裂；心肌細胞；缺血再灌注損傷

中圖分類號：R3632；R5418文獻標識碼：A文章編號：1009_816X（2017）06_0463_04

doi：103969/jissn1009_816x20170616線粒體在真核生物細胞內主要通過氧化磷酸化作用，合成三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）為各種生命活動提供能量，是細胞的能量工廠。細胞內線粒體是一種處于高度運動狀態不斷進行融合與分裂過程的細胞器，它會隨著細胞的不同生理狀態而發生適應性的改變[1]。線粒體融合、分裂之間的動態平衡對細胞正常生理功能，尤其是高能量需求的心肌細胞更為重要，這是因為線粒體占了心肌細胞總體積的30%，經氧化磷酸化作用每天可產生6kg左右的ATP以維持心臟的正常功能[2]，這足以證明線粒體融合、分裂在心肌細胞的能量代謝過程中是至關重要的[3]。目前的研究認為，心肌能量代謝障礙是心肌缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）的始發環節[4]，而相關的研究證實，由線粒體融合、分裂異常引起的線粒體功能障礙與IRI密切相關。

1線粒體融合、分裂相關蛋白的分子結構

11線粒體融合相關蛋白的分子結構：線粒體是一種多功能、雙層膜結構的半自主性細胞器，它的融合包括線粒體外膜（outer mitochondrial membranes，OMM）的融合和線粒體內膜（inner mitochondrial membranes，IMM）的融合。在哺乳動物中，線粒體外膜融合的分子學基礎是Mitofusin1（Mfn1）和Mitofusin2（Mfn2），兩者具有相似的分子結構，即N_末端保守的三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶結構域、C_末端的跨膜結構域（transmembrane domain，TMD）及TMD兩側的1個疏水基團，即卷曲螺旋式的七肽重復序列（heptad_repeat domain，HR1/2）。在線粒體外膜融合過程中，2個鄰近線粒體外膜上的Mfn1和Mfn2相互連接以啟動線粒體外膜的融合。視神經萎縮蛋白1（OPA1）介導線粒體內膜的融合，其含GTP酶結構域，中間區和GTP酶效應結構域這三個保守的結構域。研究證明，OPA1在線粒體融合過程中，既能保證線粒體內膜結構的穩定，還可參與線粒體嵴的重構[5]。

12線粒體分裂相關蛋白的分子結構：在哺乳動物中，一種分子質量為80kD的動力相關蛋白1（dynamin_related protein1，Drp1，酵母中為Dnm1）參與線粒體的分裂過程[2，6]。Drp1是一種可溶性胞質蛋白，含N_末端的GTP酶結構域，中間區的Dynamin同源結構域和C末端的GTP酶效應結構域，經以螺旋微絲的方式纏繞于線粒體的微管周圍。細胞質中的Drp1介導線粒體的分裂過程，它在線粒體外面形成一個環形結構，并進一步收縮，將線粒體分成兩個子線粒體[1]。近來的研究發現，線粒體分裂蛋白1（fission 1，Fis1），線粒體分裂因子（mitochondrial fission factor，Mff）和線粒體動力蛋白Mid49/51（mitochondrial dynamics protein of 49 and 51 kD）有利于Drp1的募集，且它們作為受體樣蛋白可單獨將Drp1募集至線粒體外膜而互不影響[7，8]。Fis1是一種分子質量為17kD的小分子蛋白，其N_末端暴露于細胞質，含多種TPR基序（Tetratricopeptide repeat motif），經C_末端的TMD錨定于線粒體外膜，通過與Drpl相互作用，促進線粒體分裂。Mff與Fis1類似，也是通過C_末端的TMD嵌入線粒體外膜。Fis1和Mff除募集Drp1外，它們還可以在線粒體分裂過程中，促進Drp1在線粒體外膜自主裝呈螺旋結構[8]。一個有趣的研究結果是Mff和Mid49/51在線粒體外膜Drp1的GTP酶活性上具有截然不同的作用效果，Otera等[9]的研究表明，Mff能將Drp1募集至線粒體外膜以促進線粒體的分裂，且過程并未受到Fis1的影響或調節；而Mid49/51卻能抑制Drp1的GTP酶活性[10]。研究發現線粒體蛋白18（mitochondrial protein of 18 kD，MTP18）、神經節苷酯誘導分化相關蛋白1（ganglioside_induced differentiation_associated protein_1，GDAP1）、endophilin B1（Endo B1）和LRRK2可能有促進線粒體分裂的作用，但它們發揮作用的具體機制還有待進一步研究。

2線粒體融合、分裂與心肌細胞的關系

線粒體通過形態改變以適應細胞周圍環境的變化，而線粒體形態變化與線粒體融合、分裂的平衡有關[11]：當抑制線粒體分裂，線粒體融合占優勢時，線粒體呈現長管網狀結構且網絡化程度增強；當抑制線粒體融合，線粒體分裂占優勢時，線粒體發生片段化，出現短棒、圓球狀線粒體。由此可見，線粒體融合、分裂對其結構和功能是至關重要的，而線粒體結構和功能的完整性是心肌保護的核心[12]。研究表明，線粒體融合和分裂相關蛋白在成人心肌細胞中具有高表達性[13]，敲除成人心肌細胞中Mfn1和Mfn2基因將產生片段化的線粒體[14，15]，而敲除Drp1基因可產生延長的線粒體[14，16]，證實線粒體融合、分裂過程在成人心臟中是普遍存在的。與成人心肌細胞線粒體相比，心臟干細胞的線粒體和胚胎或發育心肌細胞的線粒體具有更高的動態性，彼此之間的聯系也更為緊密[17，18]。事實上，線粒體重構對心肌細胞分化具有潛在的影響，這是由于線粒體外膜蛋白Mfn1和Mfn2、線粒體內膜蛋白OPA1和線粒體分裂蛋白Drp1都參與線粒體的重構過程，擾亂線粒體重構可以影響心肌細胞和成人肌細胞的分化。因心肌細胞需定期頻繁收縮而富含線粒體，線粒體融合、分裂的動態平衡不僅有利于線粒體之間的交流與溝通，而且在維持心肌細胞正常的收縮功能及能量代謝中也發揮重要的作用[19]。因此，干預心肌細胞線粒體的融合、分裂過程可能是治療心臟疾病的一個潛在靶點。endprint

3線粒體融合、分裂與心肌缺血再灌注損傷

急性心肌梗死發病率呈逐年攀升現象，盡管臨床上溶栓、介入等治療方法不斷得到改善，但有時未必能及時使缺血的心肌功能恢復，反而加重心肌的功能障礙和結構損傷等，即心肌細胞缺血再灌注損傷等，這也是其死亡率居高不下的主要原因。線粒體結構和功能的完整性是心肌保護的核心，在某些病理生理性改變如缺血或再灌注時，其結構和功能的紊亂很可能是IRI的重要原因。

31線粒體融合與IRI：線粒體融合通過稀釋線粒體受損蛋白或使正常的線粒體DNA進入有缺陷的線粒體從而起到保護作用。近來關于HL_1心肌細胞、新生嚙齒動物心肌細胞和成年嚙齒動物心肌細胞中Mfn1、Mfn2和OPA1對急性IRI的易感性研究結果不盡相同。Ong等[20]在HL_1細胞系上的研究表明，Mfn1或Mfn2過表達能抑制線粒體膜通透性轉換孔（mitochondrial permeablity transition pore，mPTP）的開放，減少心肌缺血再灌注損傷后的細胞死亡。急性IRI時，新生嚙齒動物心肌細胞中缺乏Mfn2將增加細胞的死亡數[21]，而在成年嚙齒動物心肌細胞中Mfn1或Mfn2的缺乏能降低mPTP的開放和細胞的死亡數[22]，但若同時缺乏Mfn1和Mfn2，將引起線粒體的片段化，致使線粒體的呼吸功能下降、心肌收縮功能的損傷，也將降低mPTP的開放和急性IRI后心肌細胞的梗死面積[23]。造成上述研究結果的原因是可能與Mfn2的多效性有關，在Mfn1和Mfn2雙缺失的DKO小鼠心肌中，Mfn2的缺失引起肌漿網和線粒體兩者之間的距離變遠，減少急性IRI后線粒體的鈣超載量，這在某種程度上有助于DKO小鼠表型的保護。這些研究提示我們在急性IRI時，急性抑制Mfn2可能是心肌保護的一種新策略。Chen等[24]研究半敲除OPA1（+/-）基因的小鼠心肌細胞，發現線粒體嵴異常和線粒體網絡組織紊亂，這將引起活性氧（reactive oxygen species，ROS）產物的增加和線粒體DNA的減少，最終致使線粒體功能障礙。關于H9c2細胞系的研究表明，在缺血環境的心肌細胞中發現OPA1表達明顯下降，產生片段化的線粒體[25]，且OPA1基因的部分敲除也能延遲mPTP開放，但其對心肌缺血再灌注損傷的影響還有待進一步探討[26]。綜上所述，線粒體融合與IRI之間的相互作用是相當復雜的，還需要更深入的分析。

32線粒體分裂與IRI：線粒體分裂引起線粒體能量代謝異常，促進心肌細胞的凋亡和自噬，致使心肌梗死后心室的重構。Wang等[27]研究發現，小鼠心肌細胞胞漿中Drpl蛋白水平及其磷酸化蛋白水平均降低，而線粒體外膜Drpl蛋白水平卻升高，這表明在IRI過程中，miR_499水平能影響細胞凋亡和心肌梗死的程度，其表達量下降引起鈣調磷酸酶的活化，促進Drp1的去磷酸化，產生片段化的線粒體。Ong等[28]在HL_1細胞系上的研究指出，采用mdivi_1抑制Drp1能增加心肌細胞中延長線粒體的比例，延遲mPTP開放，減少急性IRI誘導的細胞死亡并降低IRI導致的心肌梗死面積。諸多的研究證實，采用mdivi_1抑制Drp1易位至線粒體，能保護新生小鼠的心肌細胞與成年小鼠的心臟，表明在IRI時，抑制Drp1具有潛在的治療效果[29，30]。Pim_1屬于鈣調蛋白依賴性蛋白激酶家族，其基因表達能保護梗死后的心肌組織和細胞免于凋亡，且表達量的減少能增加因IRI而產生的心肌梗死面積[31]。Disatnik等[32]指出，P110是Drp1的一種特殊酞酶抑制劑，能在成年大鼠的再灌注時抑制線粒體分裂，降低心肌梗死的面積，防止心肌梗死后不良左心室的重構，改善線粒體能量代謝能力和缺血性損傷后的心臟功能。目前的研究指出，在急性IRI時，急性抑制線粒體分裂能達到保護心肌細胞的作用，而慢性抑制Drp1可能對心臟是不利的，這是由于線粒體分裂對清除受損的線粒體是必不可少的過程[33，34]。Ikeda等[35]很好地證明了當有條件性的敲除心臟特異的Drp1可以誘導線粒體的延長，抑制線粒體的自噬，增加細胞線粒體通透性轉換孔（mPTP）開放的易感性，引起心肌病并增加心肌梗死的面積。有研究表明[36]，miR_484可結合Fis1轉錄子的氨基酸編碼區以抑制Fis1的表達，從而抑制線粒體分裂，更重要的是，miR_484水平能影響線粒體的分裂，凋亡和心肌梗死程度。以上的研究表明，抑制線粒體分裂在IRI時可能是心肌保護的一種新的治療策略。

4結論與展望

線粒體在心肌的能量代謝中處于核心地位，在肌質網、肌絲及T管周圍形成復雜的網絡系統，這種特殊的空間架構使得線粒體與心肌肌絲運動所需的能量消耗、心肌細胞的興奮-收縮偶聯密切相關，若氧化呼吸鏈上的中間代謝產物出現異常，將打破線粒體的穩態，并進一步影響多條氧化還原相關的信號通路。由此可見，線粒體能夠通過“牽一發而動全身”的效果影響著心肌細胞的功能。目前的研究普遍認為，心肌能量代謝障礙是心肌缺血再灌注損傷始發環節[4]。在IRI時，線粒體融合能最大限度地提高氧化磷酸化合成ATP的能力，有利于心肌細胞的保護，而抑制線粒體分裂能防止心肌細胞的凋亡和自噬。若選擇以線粒體融合、分裂作為靶向治療IRI時，有些問題仍需考慮，如Mfn2和OPA1的多效性，Mfn2是線粒體和內質網的代謝的橋梁，且對線粒體自噬是至關重要的；除了穩定線粒體內膜的結構和嵴的重構，OPA1還能調控線粒體細胞色素C的釋放使其易于凋亡，并通過呼吸復合體促進線粒體能量的產生，這些作用可能比促進線粒體融合更為重要。值得注意的是，盡管急性抑制線粒體融合、分裂蛋白可能在心血管疾病中具有一定的治療效果，但是若慢性長期抑制線粒體融合、分裂蛋白可能對心肌細胞是不利的，具體的機制仍待進一步探索。

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（收稿日期：2017-8-31）endprint