嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌快速PCR方法檢測

張新艷

摘要 本研究根據GenBank數據庫已發表的氣單胞菌屬16S rDNA序列，設計嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌16S rDNA序列的特異保守區，建立這2種菌的快速PCR檢測方法。結果表明，僅嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌得到了特異性擴增，而幾種常見弧菌科水產病原菌，包括豚鼠氣單胞菌、易損氣單胞菌、殺鮭氣單胞菌、副溶血弧菌、創傷弧菌、溶藻弧菌和鰻弧菌并未得到特異性擴增，說明設計的引物可以用于這2種病原的PCR快速檢測方法的建立，可以為水產動物嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的快速檢測、病害預警和病原調查提供技術支撐。

關鍵詞 嗜水氣單胞菌；溫和氣單胞菌；PCR；快速檢測

中圖分類號 Q93-337 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）22-0238-02

Abstract Based on the 16S rDNA sequence of Aeromonas hydrophila published in GenBank database，the specific conserved region of 16S rDNA sequence of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria was designed and a rapid PCR method was established for the detection of these two bacteria.The results showed that only Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria were specifically amplified，while several common aquatic pathogens，including Aeromonas hydrophila，Aeromonas caviae，Aeromonas trota，Aeromonas salraonicida Vibrio parahaemolyticus，V. vulnificus，V.anguillarum，V. alginolyticusere were not specifically amplified. Thus the primers could be used for rapid detection of the two pathogens and provided the technical support for disease warning and pathogen investigation of Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria.

Key words Aeromonas hydrophila；Aeromonas sobria；PCR；rapid detection

氣單胞菌廣泛存在于淤泥、海水、淡水、土壤、污水中，代表性的有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和溫和氣單胞菌（A. sobria），可引起哺乳類動物、禽類、兩棲類以及魚類的局部感染，如皮膚潰瘍或敗血癥等[1-3]，也可以單獨或與其他致病菌共同感染，是水生動物常見致病菌，其中在魚類中最為常見，不僅給水產養殖業帶來嚴重的經濟損失，還可以通過水產動物和水產品感染人畜，導致人畜食物中毒和腹瀉，引發人類急性腸胃肌肉壞死、筋膜炎、敗血癥等，影響食品安全，已成為人-獸-魚共患病原菌，引起了水產界、獸醫學界和醫學界的高度重視[4-7]。目前，檢測菌種的方法主要有Dot-ELISA、鑒別培養基、間接ELISA等[8-11]，但都存在特異性不強或操作復雜等缺點。隨著PCR技術的發展，病原菌的檢測又多了一種方法[12-14]。本研究以公開發表的嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌16S rDNA序列的特異保守區設計一組引物，建立這2種菌的快速PCR檢測方法，旨在為水產動物嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的快速檢測和病原調查提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗菌株（表1）在福建省淡水水產研究所保存，所有菌株皆用營養瓊脂（NA）和營養肉湯（NB）（北京陸橋）進行培養、傳代。

2×PCR MasterMix、DNA marker D2000為TIANGEN產品，瓊脂糖為OXOID產品，其他為國產分析純。

1.2 引物設計

根據GenBank數據庫已發表的氣單胞菌屬16S rDNA序列設計嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌特異性引物，引物由Invitrogen公司合成，具體見表2。

1.3 細菌基因組DNA提取

從平板中直接挑取一環分離菌株細胞，接入營養肉湯培養基，在28 ℃下180 r/min振蕩培養過夜，次日取1mL菌液5 000 r/min離心收集菌體，加入100 μL無菌重蒸H2O，旋渦混勻后，沸水浴2 min，以12 000 r/min離心5 min，上清液中即含細菌基因組DNA，可直接用于PCR擴增。

1.4 引物特異性擴增

采用普通PCR進行引物特異性驗證，PCR反應在Epp-endorf Mastercycler Gradient PCR儀上進行，每個樣品分別加入2×PCR MasterMix 12.5 μL，上下游引物各1 μL，DNA（20～200 ng/μL）1 μL，用無菌超純水補足反應體系至25 μL。擴增反應參數為94 ℃預變性5 min，然后在94 ℃變性1 min，57 ℃退火1 min，72℃延伸1 min，反應循環30次，72 ℃延伸10 min。PCR反應均設置不含DNA的空白對照。PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離，用柯達凝膠成像系統記錄分析。

1.5 應用

選取實驗室近年來分離的氣單胞菌菌株50株，分別用這2對引物進行PCR擴增，同時用ELISA方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 嗜水氣單胞菌特異性擴增

使用引物對AH-F/R1對18株常見水產病原菌進行特異性擴增，結果見圖1。可以看出，僅嗜水氣單胞菌菌株得到特異性擴增，擴增得到目的條帶大小約680 bp，與預期相符。因此，該引物對可以用于嗜水氣單胞菌的特異性分析。

2.2 溫和氣單胞菌特異性擴增

使用引物對AS-F/R1對18株常見水產病原菌進行特異性擴增，結果見圖2。可以看出，僅溫和氣單胞菌菌株得到特異性擴增，擴增得到目的條帶大小約680 bp，與預期相符。因此，該引物對可以用于溫和氣單胞菌的特異性分析。

3 結論與討論

采用PCR方法對近年來實驗室分離的菌株進行檢測，嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的檢測結果與采用ELISA方法進行檢測的檢出結果一致；同時對部分菌株進行16S rDNA測序或進行微生物質譜鑒定，結果也一致。因此，可證明所建立的方法比較可靠，可用于嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌的快速檢測。

暴發性流行病的防治可通過對病原的早期診斷和長期監控等重要手段，除傳統的生理生化鑒定外，有必要建立靈敏度更高、特異性更強的快速鑒定方法。與傳統鑒定方法相比，PCR技術具有操作簡便易行、快速、準確等優勢，所以在鑒定病原菌方面得到越來越廣泛的利用[15-16]。通過比較、分析已知細菌核糖體RNA（rRNA）序列，擴增其中的特異性片段來鑒別細菌被證實是行之有效的方法[17-18]。本研究通過比對GenBank中氣單胞菌屬16S rRNA序列，設計特異性引物試圖將嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌與其他水體中常見弧菌科細菌特別是水產氣單胞菌屬細菌鑒別開來，研究中下游引物使用2種細菌兼有的共同序列，上游引物使用特異性的引物。結果表明，設計的2對引物能夠分別很好地擴增嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌，其他試驗菌株并未得到擴增，說明此引物具有很強的特異性，可以較好地應用于嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌的PCR快速檢測。

在細菌基因組DNA模板的處理上，本研究采用了熱處理菌液后直接用于PCR擴增，大幅度縮短了試驗時間，減少了中間部分操作。理論上，熱處理的DNA模板為微克級，本研究PCR法擴增的靈敏度可檢測的細菌數量為100 CFU/mL，完全能夠滿足在漁業生產中病原早期診斷、監控和暴發性流行病預警的需要。隨著PCR技術的進一步發展和完善，它將成為水產動物致病菌檢測的重要技術手段，為實驗室診斷和流行病學調查提供較好的分析依據。

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