胃癌分子標志物在臨床中的研究進展

麗敏，劉險峰 綜述；孫魯山，王虎明 審校

（1.包頭醫學院 研究生學院，內蒙古 包頭 014040；2.包頭市腫瘤醫院 外科，內蒙古 包頭 014030；3.包頭醫學院第三附屬醫院，內蒙古 包頭 014030；4.包頭市腫瘤醫院 檢驗科，內蒙古 包頭 014030）

胃癌是一種死亡率較高的慢性病，位居我國癌癥發病第二位，在農村地區不論男性還是女性，胃癌位于發病譜首位[1]。早期胃癌無明顯特異癥狀，少數患者則表現為惡心、嘔吐及腹痛等常見消化道癥狀，容易漏診。進入進展期和晚期胃癌的患者，因錯失最佳治療時機預后較差，嚴重威脅人類的生命健康。研究表明，胃癌TNM分期與患者預后及生存時間有很大關系[2]。西方國家5年生存率為5%～20%，而在日本，由于早期診斷，胃癌有較高生存率約為50%[3]，因此早期確診胃癌并積極采取治療措施，能夠明顯改善患者預后，延長患者生存期。腫瘤分子標志物是惡性腫瘤的發生、增殖過程中由腫瘤細胞的基因或應對腫瘤變化、在不同分子水平異常表達的物質[4]。這類物質在腫瘤發生的早期就表現為基因及蛋白質等不同水平表達情況的改變，在腫瘤的早期診斷和發生發展過程中有較好的應用前景。發現胃癌高危預警、早期診斷和有效治療的分子標志物，對胃癌的臨床治療具有重要意義。

1 端粒、端粒酶

端粒是位于真核細胞染色體末端的DNA-蛋白質復合體，保護染色體末端不被融合、重組和降解，能夠保持染色體結構穩定性和完整性。DNA復制過程中，每一個細胞分裂將丟失約30～200 bp的端粒DNA重復序列。當端粒縮短至臨界長度時，細胞進入衰老狀態，端粒不能再縮短時，細胞就無法繼續分裂[5]，因此端粒研究一直以來與人類衰老及長壽等問題相關。端粒酶是一種核蛋白逆轉錄酶，由人端粒酶逆轉錄酶（human telomerase reverse transcriptase,hTERT）、人端粒酶RNA組分（human telomerase RNA component,hTR）以及人端粒酶相關蛋白（telomerase associated protein 1,TP1）3部分組成[6]。端粒酶能以自身hTR中RNA為模板，在hTERT逆轉錄作用下生成端粒DNA，使端粒長度得以維持，為細胞持續分裂提供遺傳基礎，賦予細胞“永生化”。hTERT是端粒酶的催化亞基和活性中心，是決定端粒酶活性的關鍵因素。除少數具有增殖潛力的人體正常細胞如人造血細胞、干細胞和生殖細胞外，絕大多數正常細胞中端粒酶表達抑制或不表達，但在超過90%的人類惡性腫瘤細胞中檢測到端粒酶的明顯表達，因此人們推測端粒酶的激活可能與腫瘤細胞無限的復制潛力有關[7]。近幾年，端粒酶在腫瘤發生、發展的微觀機制有了一定的研究進展，有報道稱，hTERT與肝素酶協同作用共同促進了腫瘤細胞的生長。而肝素酶在腫瘤侵襲轉移、新生血管生存、影響細胞分化以及促進腫瘤細胞黏附作用和侵襲力等調節過程中發揮重要作用[8]。還有研究顯示，hTERT為腫瘤細胞提供復制特性和不朽性是通過過度活化腫瘤干細胞（cancer stem cells,CSCs）實現的，CSCs賦予腫瘤細胞無限分化、增殖能力。因此，hTERT/端粒酶活性可能成為抗腫瘤治療的普遍生物標志物[9]。

Nowak等[10]對胃癌、結腸癌患者的癌區以及癌旁正常黏膜組織的分離細胞進行端粒酶復合物（hTERT、hTR和TP1）3種成分表達情況和端粒酶活性檢測，研究發現，所有正常黏膜樣品和外周血淋巴細胞分離的RNA中檢測到hTR的表達，多數正常細胞中亦存在TP1和hTERT的表達，但正常細胞產生的擴增信號要比惡性細胞弱得多。在胃癌和結腸癌細胞中所有端粒酶組分（hTERT、hTR和TP1）產生非常強的擴增信號，并呈現一致性高表達，癌細胞hTERT和TP1表達比正常細胞高至少25倍，而端粒酶活性能夠超出正常細胞的100倍以上。因此，端粒酶定量分析在胃癌和結腸癌早期診斷中是一個較好的癌癥標志物。劉麗等[11]研究顯示，在萎縮性胃炎、腸化生、不典型增生和胃癌等不同胃黏膜病變過程中，隨病情變化hTERT蛋白表達率呈明顯上升趨勢，提示hTERT在胃癌前病變階段已經發揮作用并且能夠反映癌癥進展程度，很多研究也證實這一結論。Kang等[12]采用實時定量逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR）技術檢測118例胃癌患者、40例慢性萎縮性胃炎患者和58例正常對照者的循環hTERT mRNA，結果胃癌患者中循環hTERT mRNA顯著高于萎縮性胃炎及正常對照組，其高水平與臨床分期和淋巴結轉移顯著相關。ROC分析顯示循環hTERT mRNA在胃癌患者中的敏感性為66%，特異性為87%，其診斷能力明顯高于癌胚抗原（carcino-embryonic antigen,CEA）和癌抗原19-9（CA19-9）。hTERT mRNA可以做為無病生存和總生存的獨立預后因素。

2 抑癌基因p53

p53是一類常見的抑癌基因，它編碼的蛋白質產物是一種轉錄因子，能夠控制細胞周期的啟動。p53對細胞分裂起著減慢或監視的作用，當細胞受損、無法修復時，p53蛋白將參與啟動過程，通過抑制細胞分化、促進細胞凋亡、衰老以及細胞自噬等途徑抑制腫瘤細胞的生長。該基因突變發生在約50%的惡性腫瘤患者中，突變的p53基因失去對細胞周期的正常負反饋調控作用，允許細胞的增殖與惡性轉化[13]。

突變型p53可通過調節血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）促進腫瘤血管生成是惡性腫瘤發生發展過程中的關鍵環節[14]。YU等研究顯示，胃癌組織中p53、VEGF陽性表達率均為51%，二者與胃癌TNM分期呈正相關，但在不同胃壁浸潤深度組間無顯著性差異，低分化胃癌p53蛋白表達高于高分化胃癌，正常組織和慢性淺表性胃炎均未發現p53和VEGF陽性表達[15]。p53基因突變直接影響到突變p53蛋白的表達水平，陽性率越高代表突變p53蛋白表達水平越高。在不同程度的慢性萎縮性胃炎、腸上皮化生和不典型增生的病變組織中這兩種物質存在陽性表達，陽性率隨病變進展而增加。p53基因突變表達在胃癌中的研究報道較多見，并且均證實上一結論。

3 抑癌基因p16

p16基因（又名MTS1基因）是一種抑癌基因，長度為8.5 kb，它編碼的蛋白能夠抑制CDK4激酶活性，能夠阻止細胞從G1期進入S期，以而抑制腫瘤細胞生長。胃癌患者癌組織中頻繁出現p16基因啟動子CpG島（基因啟動子和外顯子區域，胞嘧啶和鳥嘌呤相對集中的部位）甲基化，胃癌組織中p16基因甲基化檢出率可達56.8%[16]，說明表觀遺傳學參與胃癌的形成過程、促進腫瘤的發生。抑癌基因甲基化能夠破壞編碼蛋白的合成轉錄過程，致使基因的表達不能正常進行，抑癌基因表達極度減少或不表達，無法發揮抑癌功能促進腫瘤發生。在組織惡變之前的p16基因甲基化有助于腫瘤的早期診斷。p16基因的突變、缺失導致p16基因蛋白失活，是胃癌發生發展的另一重要機制[17]。該基因發生異常突變時，失去對CDK4激酶的抑制作用，細胞無限量增殖，這也是正常細胞引起癌變的重要原因。研究顯示p16基因在胃癌組織中表達明顯降低為32.3%，顯著低于癌旁正常胃黏膜表達的81.5%，p16的表達與胃癌的分化程度、淋巴結轉移呈負相關。p16基因在抑制腫瘤細胞增殖中發揮重要作用，p16基因產物失活使腫瘤細胞具有較高的增殖和轉移活性[18]。

4 非編碼RNA

非編碼RNA（non-coding RNAs,ncRNAs）即不編碼蛋白質的功能性RNA分子。最新測序技術顯示，人類絕大部分基因組被轉錄，編碼蛋白質的基因只占人類基因組的3%，絕大部分則轉錄成ncRNAs[19]。長期以來，ncRNAs被認為是沒有用的轉錄產物，近年來隨著科學技術的進步，人們發現非編碼RNA參與調節轉錄干擾、端粒維持、表觀遺傳修飾、轉錄后調節及細胞分化發育等多種生物學功能，在機體正常發育和疾病中均發揮關鍵的調節作用[20]。根據長度非編碼RNA分為兩類：短鏈非編碼RNAs（包括siRNA、miRNA、piRNA）以及長鏈非編碼RNAs（lncRNA）。研究發現，ncRNAs在腫瘤細胞中的表達水平跟正常組織相比有明顯改變，功能上發揮正向促進和負向抑制兩種調控作用，目前腫瘤相關非編碼RNA研究較多的兩大類標志物要屬miRNA和lncRNA。

4.1 微小RNA

微小RNA（miRNA）是一種高度保守的非編碼RNA序列，其長度一般為19～24個核苷酸。目前為止，miRBase數據庫中人類成熟microRNA有 2 588種（http://www.mirbase.org/）， 其 中 超過30多種miRNAs的異位表達與胃癌形成有關。miRNA的研究方法有Northern雜交、實時PCR和微陣列芯片等技術，微陣列已經成為最廣泛應用于miRNA研究的芯片，這種方法便于操作，而且它的高通量特性使其能夠對整個基因組miRNA進行分析[21]。miRNA在腫瘤組織和正常組織間存在差異表達。胃癌中，miR-21、miR-125b、miR-100、miR-199a、miR-27a、miR-130及 miR-181b等miRNA表達升高，對胃癌的形成起誘導作用[22]。而有些miRNA在胃癌中表達較低水平、發揮抑制作用，如miR-1266、miR-1207-5p和miR-1182等[23]。雖然這類miRNA表現出相反的變化趨勢，但起到相同的作用效果，在腫瘤細胞增殖和分化過程中發揮重要作用。miR-32、miR-182和miR-143在腸型胃癌患者中的顯著變化，說明miRNA表達譜可能成為不同分型的胃癌診斷標志物[24]。

4.2 長鏈非編碼RNA

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度大于200 nt的非編碼RNA的一種，在腫瘤的發生發展中起重要作用。lncRNA在表觀遺傳學、轉錄水平及轉錄后水平中參與細胞生長發育過程的幾乎整個生命周期基因調控過程。lncRNA表達失調時會引發多種疾病，如惡性腫瘤、心血管疾病及代謝性疾病等[25]。胃癌中存在許多異常表達的lncRNA， 如 H19、HOTAIR、TUSC7、MEG3及MALAT1能夠顯著調節胃癌進展中細胞增殖、細胞周期、凋亡、侵襲及轉移等階段[22]。陳偉等[26]的研究顯示，240例胃癌樣本及32例正常癌旁樣本的12 068個lncRNA表達數據中，有61個差異表達的lncRNA，46個表達上調，15個表達下調。HOTAIR、GHET1、H19及 FENDRR 等 lncRNA在胃癌中確實出現異常表達，ANRIL、GAS5在腫瘤和正常組織中無明顯差異。Okugawa等[27]通過實驗證明MALAT1、HOTAIR表達升高與胃癌腹膜轉移顯著相關，MALAT1高表達沒有與預后不良相關，而HOTAIR高表達組與低表達組相比預后明顯差。高HOTAIR表達可以做為胃癌腹膜轉移的一個獨立的預后及危險因素。Hashad等[28]評估胃癌患者血漿中循環lncRNA H19表達，認為循環H19的上調與胃癌在疾病晚期進展性上調密切相關，在胃癌中作為潛在的非侵入性診斷生物標志物發揮作用。血漿H19與CEA聯合檢測能夠提高胃癌的診斷效率，ROC曲線下面積AUC由單項的72.4%上升為80.4%。

5 展望

經典血清學腫瘤標志物在胃癌的臨床實驗室診斷中應用最為廣泛，而分子生物學技術診斷雖然在胃癌產生機制等方面更具說服力，但因檢測的各種條件要求較高，分子標志物目前多應用于科研領域，臨床應用有限。如何將實驗操作及研究成果應用于臨床實踐涉及到轉化醫學的內容，轉化醫學在整個醫學模式的轉變中發揮至關重要的作用[29]，這也是一切科學研究最好的歸宿。隨著無創檢測技術的發展，胃癌分子標志物在血液中檢測可以很大程度避免有創檢查帶來的危害，為患者減輕痛苦。目前，能夠進行血液檢測的分子標志物種類有限，開發循環分子檢測技術和方法對于腫瘤分子標志物的推廣及使用是很關鍵的，這將為疾病的診斷和治療提供新靶點，并為患者的生存和預后帶來希望。