侵襲性肺曲霉菌病診斷方法的研究進展

任增花， 徐 凌

上海交通大學附屬第六人民醫院呼吸內科，上海 200233

近年來，隨著廣譜抗生素、糖皮質激素、細胞毒藥物及免疫抑制劑的廣泛使用，HIV感染者的增多以及導管介入、放療等的大量開展，肺部真菌感染呈上升趨勢，其中最為嚴重的是侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)。IFI中最常見的病原菌為曲霉菌[1]。曲霉菌多存在于潮濕、陰暗且通風不良的環境中，其孢子飄浮于空氣中易被吸入，因此以感染肺部最常見。侵襲性肺曲霉菌病(invasive pulmonary aspergillosis，IPA)是最常見的侵襲性曲霉菌病(invasive aspergillosis，IA)，發病率逐年升高，且致死率高[2]。IPA的診斷金標準為病理學檢查，但其實施較困難，因此，尋找新的能夠早期迅速診斷IPA的方法具有重要臨床意義，目前多項研究致力于為IPA的早期診斷提供依據。

1 影像學檢查

IPA臨床癥狀和體征缺乏特異性，影像學檢查為其重要輔助診斷方法。胸部CT檢查可確定病變部位、數量、大小，輔助判斷病變性質。根據CT表現，可將IPA分為血管侵襲性和氣管侵襲性。氣管侵襲性IPA侵犯氣管基底膜和細支氣管，CT上可表現為沿支氣管血管束分布的斑片狀模糊影、磨玻璃影及多發小葉中心結節、樹芽征；血管侵襲性IPA CT上多表現為多發胸膜下實變影或結節、團塊影，伴有暈輪征、空氣新月征、空洞等，空氣新月征和空洞常重疊出現[3]。有文獻[3]報道，IPA氣管侵襲常發生于非血液疾病繼發的IPA，而其血管侵襲多發生于血液系統腫瘤患者。暈輪征在起病后1～2周出現，表現為結節或實變周圍磨玻璃影。空氣新月征在起病后2～3周出現，表現為空洞或空腔內的球形病灶與洞壁之間的新月狀透亮影。典型的暈輪征、空氣新月征對診斷IPA具有一定的特異性，但并不多見[4-5]。也有研究[6-7]認為由于曲霉菌侵襲血管， CT肺血管造影(computed tomography pulmonary angiography，CTPA)可發現血管閉塞癥，此征象在診斷IPA時比傳統CT的暈輪征和空氣新月征具有更高的比值比(OR)，且其陰性結果具有更低的陰性似然比(0.11～0.21vs0.47～0.83)，因此排除IPA的價值更大。

2 微生物學檢查

2.1 標本鏡檢 典型的曲霉菌形態表現為無色、分隔、45°分支、直徑3～12 μm的菌絲；當曲霉菌存在于空洞病灶或竇中時，可見具有分生孢子的囊泡[8]。痰是最常用的鏡檢標本，曲霉菌的致炎導致大量膿細胞聚集，當痰涂片直接鏡檢發現大量膿細胞時，可初步排除定植。革蘭染色法可見特征性結節狀結構，此為曲霉菌絲被中性粒細胞包裹而形成，可見中性粒細胞核固縮和核碎裂，為曲霉菌產生的膠霉毒素(gliotoxin，GT)導致中性粒細胞凋亡所致[9]。蘇木精-伊紅(H-E)染色中，由于真菌孢子和菌絲呈淺紅色，不易與背景顏色區分，檢出率不佳。KOH飽和液染色法可破壞痰液中的細胞成分而保留菌絲完整性，提高曲霉菌檢出率。碘酸雪夫染色(PAS)染色使菌絲呈紅色；六胺銀染色(GMS)染色使菌絲呈黑色，從而區別于背景色，提高檢出率[10]。

對于活檢標本，可使用改良的Calcofluor熒光染色法在光鏡和熒光顯微鏡下進行觀察：光鏡下見固有形態，熒光顯微鏡下真菌則呈亮藍色[11]。組織病理學雖為診斷金標準，但臨床上懷疑IPA的患者常因病情較重而無法行肺活檢，且組織病理學檢測存在約20%的假陰性結果[8]，因此限制了其應用價值。除痰液及活檢標本外，支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)、氣管內吸引物、胸腔積液也為常用標本。

2.2 培養法 用于培養的標本類型多樣，無菌部位標本培養結果陽性有確診價值。培養條件標準化有利于曲霉菌呈現典型形態，大體上為絨毛狀、頂端膨大、放射狀排列的分生孢子頭。菌落顏色及分生孢子頭形態為群的劃分依據。基于不同曲霉菌的生長特性，可通過改變培養條件達到鑒別診斷的目的，例如：提高培養基含糖量可加快局限曲霉菌的生長速度；對于耐高溫曲霉菌，可通過提高生長溫度進行鑒別(曲霉菌于25～37℃均可生長)。然而，曲霉菌培養靈敏度在不高，培養法耗時長，難以用于早期診斷，且不能確定是正常菌群還是感染所致[12-14]。

3 抗原檢測法

3.1 半乳甘露聚糖(galactomannan，GM)試驗 GM是曲霉菌在組織中生長時釋放的細胞壁的組成部分，可以在血清、痰液和其他無菌體液中被檢測到。檢測方法有乳膠凝集試驗和酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，使用ELISA法檢測GM是目前公認的最為敏感的檢測方法。GM試驗標本的選取主要為血清和BALF。GM可被中性粒細胞清除，因此非中性粒細胞減少患者血清GM的檢測對IPA的診斷價值有限。BALF中GM局部濃度高，且可避免中性粒細胞的影響，因此其靈敏度及特異度均高于血清[15-17]。以血清為標本時，GM界值取0.5較為恰當[18]；以BALF為標本時，GM界值應大于0.5，否則將增加假陽性結果[19]；多數文獻[20-22]支持1.0為以BALF為標本時GM理想的陽性閾值。一項meta分析[21-23]顯示，GM試驗BALF的界值為1.0時，診斷的靈敏度、特異度分別為86%、95%；而血清GM試驗以0.5為界值時，其靈敏度、特異度分別為65%、95%。但對于慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者，研究[21]顯示，當BALF界值取0.5時，診斷的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值分別為88.9%、88.4%、72.7%、95.8%，與界值為1.0(66.7%、96.2%、85.7%、89.3%)相比，診斷效率更高。對于COPD患者，也可選擇痰液為標本，可減少侵入性操作帶來的不適，相比，其診斷靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值與BALF標本差異無統計學意義，且略高于血清標本[24]。以血清為標本時，采用連續重復測量的方法可明顯增加特異度，但可降低靈敏度，同時陰性預測值并不明顯降低[25]。

近期一項研究[26]將BALF-GM試驗與BALF-3-乙酰鐮孢氨酸(triacetylfusarinine C，TAFC)檢測相結合來提高血液系統惡性腫瘤患者IPA的診斷效率。TAFC是由煙曲霉菌產生的鐵載體之一，介導感染過程中宿主鐵的獲取。該研究顯示，BALF-GM試驗與BALF-TAFC聯合檢測可將診斷靈敏度從單用GM試驗的53%(以1.0為界值)、73%(以0.5為界值)提高到73%、87%，預示兩者聯合將有良好的應用前景。Reischies等[27]探討了尿GM/尿肌酐用于診斷血液系統惡性腫瘤患者IA的價值，發現當取界值為0.26時，其診斷IA的敏感性為79%、陰性預測值>98%，而陽性預測值僅為13%，因此認為尿GM/尿肌酐用于排除IA的價值較大。該研究以尿液為標本，標本留取方便、非侵入，可獲取樣本量大，為GM檢測IPA的進一步研究提供了新思路。但由于該研究樣本量小(n=79)，且未區分IA種類，故用于診斷IPA的價值尚需進一步研究。

雖然GM試驗是目前檢測IPA較為敏感的方法，但其假陽性和假陰性問題仍不可忽略，存在以下情況時應考慮假陽性的存在[16, 18-19, 28-30]：(1)使用半合成青霉素尤其是哌拉西林或他唑巴坦；(2)患者患有多發性骨髓瘤；(3)異體骨髓移植患者、移植物抗宿主病患者、自身抗體陽性患者、菌血癥患者及腸道雙歧桿菌定植的嬰兒；(4)使用含有GM的血制品；(5)存在青霉屬、鏈格孢霉屬、擬青霉菌屬、鐮刀菌屬、組織胞漿菌和隱球菌屬等其他真菌感染。假陰性原因[15, 31]：(1)在IPA早期階段，血管只是輕微受侵犯，釋放入血液的真菌數量不足；(2)應用抗真菌藥物。

3.2 BALF檢測(1,3)-β-D葡聚糖(G試驗) (1,3)-β-D-葡聚糖[(1,3)-beta-D-glucan，BDG)]存在于除隱球菌和接合菌之外的各種真菌屬細胞壁中。真菌通過吞噬細胞的吞噬和消化功能，將其細胞壁中的抗原物質BDG釋放入人體的血液或其他體液中。因體液中BDG代謝不穩定，故體液BDG檢測的診斷價值是否優于血清須進一步研究。根據采用的界值不同，血清G試驗總體靈敏度波動在80%～90%，特異度波動在36%～92%[17]。一項meta分析[32]表明，血清標本采用中華鱟卵蛋白試驗以20 pg/mL(AUC-SROC=0.9943)為界值，采用美洲鱟卵蛋白試驗以60 pg/mL為界值(AUC-SROC=0.897 3)時，均具有較好的診斷價值，前者靈敏度、特異度分別為93%、100%，后者靈敏度、特異度分別為81%、67%。

有文獻[17, 33]比較了G試驗和GM試驗在IPA早期診斷中的價值，結果表明，G試驗在高危患者IPA的早期診斷中價值可能更大。通過G試驗診斷IPA時，須注意G試驗陽性可見于除隱球菌和接合菌之外的各種侵襲性真菌病[30]。此外，須注意假陽性及假陰性的問題。假陽性見于[17, 34-36]：(1)使用以真菌為原料制成的抗生素，如哌拉西林或他唑巴坦、阿莫西林或克拉維酸；(2)使用抗腫瘤的多糖類藥物，如香菇多糖、云芝多糖K等；(3)使用白蛋白、球蛋白等；(4)使用纖維素膜進行血液透析者；(5)菌血癥患者；(6)待檢血樣為溶血標本；(7)血液接觸被葡聚糖污染的血液收集管或紗布。假陰性見于[15, 31]：(1)機體免疫功能極度低下，無法排除真菌感染，BDG就無法釋放至血液中；(2)使用抗真菌藥物治療，如使用卡泊芬凈，其可非競爭性抑制BDG合成。

3.3 雙甲硫基膠霉毒素[bis(methylthio)gliotoxin，bmGT]檢測 GT是煙曲菌產生的真菌毒素之一，對哺乳動物細胞具有免疫抑制及促凋亡作用，存在于患者血清和BALF中[37-38]，但有活性的GT會很快被組織和細胞代謝而難以被發現。bmGT是膠霉毒素的衍生物，相對穩定，可在血清中被檢測到。Domingo等[39]發現，bmGT可在獲得真菌感染證據之前被檢測到，且不存在于健康人血清中。bmGT檢測與GM試驗具有相似的特異度和陰性預測值，但bmGT檢測有更高的靈敏度和陽性預測值。bmGT檢測聯合GM試驗可提高曲霉菌的陽性預測值(100%)和陰性預測值(97.5%)，預示其可作為曲霉菌病的診斷指標[39-40]。

3.4 免疫層析側流儀(immunochromatographic lateral flow device，LFD)法 該法目前多采用單克隆抗體(MAb-JF5)檢測曲霉菌抗原。靶抗原不同于GM，是一種細胞外糖蛋白，僅在曲霉菌活躍生長時分泌，可作為曲霉菌感染的生物學標志。待檢標本可選用血清、BALF。一項meta分析[41]顯示，以血清為標本，LFD法診斷IA的靈敏度為68%、特異度為87%，診斷優勢比(diagnostic odds ratio，DOR)為11.90。LFD法中使用血清為標本時須對血清進行預處理，且對預處理的要求較高。相比血清，LFD法以BALF為標本診斷IA時不需預處理。一項meta分析[41]顯示，LFD法以BALF為標本診斷IA的靈敏度為86%、特異度為93%、DOR為65.94。

近年來，多項研究[42-44]表明，LFD法以BALF為標準診斷IPA的效率較高，其陰性預測值為95%～100%。Castillo等[45]比較了LFD法與GM試驗在高危IPA患者中診斷的靈敏度及特異度，結果表明，兩者的診斷性能相當，靈敏度均欠佳但特異度均較高，且聯合使用并不改善診斷效能。對無法獲取BALF的IPA患者，可聯合使用曲霉菌特異性單克隆抗體JF5與PET/MRI。JF5能引導放射性核素濃集于感染部位，從而追蹤曲菌生長活躍的肺組織[37]。該方法重復性好，約15 min出結果，但患者應用抗真菌藥物時可出現假陰性，且肉眼觀察易出現偏差[31]。此外，IPA患者尿液中含有真菌GM樣抗原，基于此抗原設計的新型單克隆抗體MAb476用于LFD(MAb476-LFD)檢測的方法已被開發，該技術以尿液為標本，類似“尿妊娠實驗”，可快速實時檢測IA感染，方便快捷，但其可行性須進一步研究驗證[46]。

4 抗體檢測法

抗體的產生需要有一定的時間且要求機體免疫應答能力正常，而大多數血液系統惡性腫瘤、造血干細胞移植、長期應用糖皮質激素等患者免疫應答能力不足，且IPA患者短期內通常不發生血清轉化和抗體反應。因此，抗體檢測的臨床應用價值不大。

5 分子生物學方法

5.1 核酸分子雜交和擴增技術 聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)也可用于診斷IPA。PCR的診斷效率不低于GM試驗和G試驗[47]。BALF-PCR檢測方法比GM試驗和G試驗特異度更高，更適合于診斷試驗[48]。目前已有很多種PCR技術用于檢測各種臨床標本中的霉菌且有較高的診斷率，如巢式PCR、實時定量PCR、多重PCR、熒光定量PCR、PCR-限制性片段長度多態性分析(RFLP)技術、隨機引物擴增DNA多態性(RAPD)技術等。

巢式PCR雖靈敏度高，但因其需要2次PCR反應，增加了污染機會[49]。PCR檢測的標本可選用血、BALF、腦脊液等。因曲霉菌孢子可存在于口腔和上呼吸道，BALF極易被污染，PCR難以分辨定植和侵襲感染。因此，區別于GM試驗，血液是PCR的首選標本。對同一血液標本的線粒體和核糖體同時行實時定量曲霉菌PCR檢測，可提高其早期診斷效率[50-51]。有文獻[49]報道，全血或血清實時PCR檢測技術在ICU患者中診斷IA感染的靈敏度及特異度分別為66%、98%。因血循環中真菌DNA是不連續釋放的，一般建議每周至少檢測2次，單次結果陽性需考慮假陽性，可能由污染、呼吸道IA定植或臨床樣本中IA一過性存在導致；假陰性則與抗真菌治療過程中血中真菌負荷快速減小有關[52]。然而，目前PCR法缺乏標準化的操作技術和質量評估方案，致各研究間敏感性和特異性差異顯著，且檢測費用較高、檢測時間較長，使其在IPA診斷中的使用受到阻礙。

在PCR技術基礎上發展起來的依賴核酸序列的擴增技術(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)不要求溫度循環，可恒溫擴增RNA，在30 min內即可產生1 012個擴增子，擴增的單鏈RNA很容易被探針檢測到，故可從臨床樣本中快速靈敏地檢測曲霉菌。一項以大鼠為研究對象的動物試驗[53]表明，相比較實時PCR和培養技術，實時NASBA檢測曲霉菌的靈敏度更高。一項前瞻性多中心研究[54]證實，血標本NASBA監測可用于評估抗真菌治療反應，曲霉菌RNA負荷在應用抗真菌藥物治療4～6周的變化可預測患者治療12周的預后，抗真菌藥物治療4～6周真菌負荷無下降提示12周預后不佳。

5.2 基因探針 真菌核糖體RNA的堿基序列由可變區和保守區組成;利用保守區可設計通用探針；利用可變區可設計針對不同菌種的特異性探針。嗎啉寡聚物(morpholino oligomers，MORFs)通過Watson-Crick堿基配對與其互補的DNA或RNA結合，并對核酸酶具有抵抗性，與血清蛋白質結合率低，可進入細胞并在循環中被迅速清除。因此，有研究[55]用99mTc標記的MORFs探針靶向真菌核糖體RNA，結合SPECT成像用于檢測曲霉菌感染，這有望成為診斷曲霉菌感染的新方法。

5.3 基質輔助激光解吸/電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)技術 該技術將真菌光譜與已知數據庫中的物種特異性肽光譜指紋圖譜對比，進行診斷IPA。不同于細菌，絲狀真菌須破壞細胞壁后提取其蛋白質[56]，這促使該技術不斷更新以提高診斷效率[57]。Alanio等[58]用MALDI-TOF-MS技術鑒定曲霉菌屬，鑒定能力可達到種的水平，因此，該技術可提高IPA診斷效率，且菌種鑒定更加準確。但為提高MALDI-TOF-MS的診斷有效性，數據庫中菌株的特異性肽光譜指紋圖譜應涵蓋種內變異種。Tam等[59]通過對3個獨立的DNA區域[內部轉錄間隔區(internal transcribed spacer，ITS)、β-微管蛋白和鈣調蛋白基因]進行擴增和測序，進一步區分了與黃曲霉菌相似的特異曲霉菌(A. nomius)和溜曲霉菌(A. tamarii)，提示利用基因檢測可輔助完善該技術數據庫，提高其檢測準確性。

5.4 血清微小RNA 研究[60]顯示，IPA和肺癌患者血清中miR-21均高表達，但miR-21血清水平為0.198～0.723時才對鑒別診斷IPA有較好的價值；miR-21聯合G試驗和GM試驗診斷IPA的價值優于各單項或雙項聯合。因此，可以認為miR-21是潛在的IPA診斷血清標志物。

5.5 細胞因子 Gon?alves等[61]探討了BALF中細胞因子水平與IPA的關聯性，結果顯示，IL-8肺泡水平≥904 pg/mL預測IPA的敏感性和特異性分別為90%、73%，陰性預測值88%，說明IL-8是IPA良好的生物標志物。此項研究突出了IPA患者中肺泡細胞因子呈一定特異性。同時，Heldt等[62]研究認為，血清和BALF中IL-6和IL-8水平與IPA有關，提示細胞因子用于診斷IPA的潛在價值。

6 呼氣檢測

有研究[63]指出，IPA患者會呼出特定的揮發性有機化合物(volatile organic compounds，VOCs)，電子鼻可以通過分析呼出的VOCs來區分各種肺部疾病，從而診斷IPA(準確性為90.9%)。此法價廉且無創，在幾分鐘內即可得出結果，但其有效性目前缺乏臨床大樣本研究驗證。

7 小 結

IPA早期診斷的方法較多，包括傳統的真菌涂片、真菌培養、GM試驗、G試驗、PCR法等。真菌涂片快速經濟，仍為其重要的檢查手段。培養可進一步提高診斷敏感性，但需時較長。GM試驗標本主要為血清及BALF，以BALF準確性較高。近期有學者通過聯合BALF-GM試驗與BALF-TAFC檢測來提高血液系統惡性腫瘤患者IPA的診斷效能，或用尿GM/尿肌酐檢測血液系統惡性腫瘤患者IA，為GM檢測IPA提供了新思路。G試驗標本主要為血清。對于不便于應用GM、G試驗又須快速得到結果的患者，可使用PCR法。在PCR技術基礎上發展起來的NASBA可恒溫快速擴增RNA，較傳統PCR診斷靈敏度更高。其他如bmGT、LFD、MALDI-TOF-MS技術、血清微小RNA檢測、肺泡細胞因子IL-8檢測等同樣有潛在的應用前景。CT檢查特異性不佳，可作為診斷IPA的參考。無論何種診斷方法，均須考慮假陽性、假陰性問題，綜合個體情況考慮診斷是否成立。總之，對于懷疑IPA的患者，需充分評估病情，合理利用各種檢測方法，爭取早期準確診斷、早期給予有效治療，避免漏診及誤診，提高患者生存率。