同型半胱氨酸致出生缺陷的機制研究進展

黃青青 錢燕 王丹

出生缺陷是指胚胎或胎兒在發育過程中發生解剖學和/或功能上的異常[1]。出生缺陷發病機制復雜，遺傳和/或環境因素交互影響參與其發生[2]。近年來國內外研究報道都證實了同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）與先天性心臟?。╟ongenital heart disease，CHD）、神經管畸形（neural tube defects，NTDs）和唇裂等多種出生缺陷的發生密切相關[3-5]。鑒于出生缺陷發生率逐年增加，探尋Hcy誘發出生缺陷的分子機制至關重要。因此，本文就Hcy導致出生缺陷的分子機制作一綜述。

1 H cy與血流動力學改變

胎盤及胚胎內臟器穩定的血流動力學是維持胚胎生存及發育的基礎。研究顯示，發育早期的雞胚注射低濃度Hcy后，在胚齡3.5d（相當于人胚胎5～8周）時，雞胚左、右心室射血分數，峰流速及流出道收縮時間均顯著下降，而流出道舒張時間延長；同時，Hcy組雞胚心率明顯低于對照組。而此時B超卻未發現明顯的形態學異常，提示Hcy能夠直接誘發胚胎重要臟器血流動力學紊亂，而且這種改變早于形態學畸形的發生[6]。另有研究通過靜脈夾閉實驗驗證了上述結果，即通過夾閉發育早期（胚齡4d）雞胚的對橫向卵黃靜脈5h，心臟內血流動力學參數發生急劇下降，雞胚心臟后期出現明顯的流出道畸形，特別是室間隔缺損、瓣膜異常和咽部主動脈畸形，且畸形與Hcy處理導致的畸形類似[7]。以上證據提示，Hcy能通過引起血流動力學紊亂，從而誘發多種類型的CHD。

有研究報道，給予雞胚50、75和100mM的Hcy處理72h后發現，胎盤血管密度分別減少50.3%、70.6%和74.0%，同時，雞胚存活率下降32%、50%和66%[8]。說明Hcy可能通過抑制血管生成削弱胚胎存活力。隨著Hcy病理機制的深入研究，Latacha等[8]發現Hcy可以從基因和蛋白水平抑制血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達。VEGF是關鍵的血管生成調控因子，其表達的下降會導致胎盤/胚胎血管生成受抑，組織血流重新分布，間接加劇了胚胎血流動力學的紊亂。另外，Hcy作用后，心臟局部組織中內皮素-1（endothelin-1，ET-1）表達下降，內皮型一氧化氮合酶-3（endothelial nitric oxide synthase-3，eNOS-3）表達增加，這兩者作用相互制衡[9]。ET-1作為另一種血管生長因子，負責血管收縮的調控；eNOS-3介導一氧化氮的合成，并負責血管舒張。在血流正常的心臟中，eNOS-3通常表達于高剪應力的組織中，如房室管和流出道；而ET-1往往在低剪應力的組織中呈高表達。隨著胎盤/胚胎血管分布及其血流動力學的改變，胚胎臟器內部血流供應減少，血管剪應力也隨之降低[7]，繼而導致ET-1和eNOS-3表達及分布異常，最終引起臟器發育不平衡[6，9]。

以上證據提示Hcy可通過改變胎盤及發育早期胚胎臟器的血流動力學參數，引起臟器時空發育紊亂，從而導致臟器的形態學畸形。

2 H cy與D N A損傷

研究發現，當體內Hcy水平過高時，機體需要更多的葉酸來代謝過多的Hcy[10]；增加葉酸攝入可改善高同型半胱氨酸血癥（hyperhomocysteinemia，HHcy），兩者水平呈負相關；提示HHcy會導致葉酸相對不足。有報道認為，體內葉酸不足時，胸腺嘧啶合成障礙，尿嘧啶（dUMP）被錯誤地摻入DNA鏈中，機體將啟動以下兩種反應：（1）如果在互補DNA雙鏈上同時摻入dUMP，后者會被損傷修復系統識別并切除，導致DNA雙鏈斷裂，進而誘發染色體離斷；（2）若dUMP未被切除，則會在DNA復制過程中會產生G-C替換，引起點突變。表明HHcy可以通過引起葉酸“相對不足”，誘發DNA損傷。

Hcy還能直接誘發DNA損傷。Ye等[11]體外分離培養海馬神經元并予以0.25mM Hcy處理4h，堿性彗星試驗（檢測DNA鏈斷裂）檢測發現70%的神經元細胞核呈現損傷的陽性拖尾，而對照組陽性細胞核只占8%，提示Hcy可造成細胞DNA鏈斷裂。研究發現亞甲基四氫葉酸還原酶（methylene tetrahydrofolate reductase，MTHFR）發生C667T或A1298C突變者，血漿Hcy水平升高。MTFHR C667T TT基因型者和C667T CT或C667T CC基因型者相比，血漿Hcy水平升高更為明顯；同時，C667T TT基因型者細胞DNA損傷程度也較C667T CC或C667T CT基因型者更為嚴重。提示Hcy能夠直接誘發DNA損傷，且呈濃度依賴性。不僅如此，Fenech[12]收集不同年齡健康人的淋巴細胞發現，血漿Hcy濃度與染色體微核（染色體異常表現之一）形成呈正相關；而通過葉酸降低Hcy水平，能夠緩解染色體微核的形成。另有研究顯示，HHcy可導致人類21號染色體發生異常，從而增加Down’s綜合征的發生風險。說明Hcy不僅損傷DNA，還可造成染色體異常，影響人類基因組的穩定性[12]。

以上研究提示飲食和/或遺傳因素造成的高水平Hcy都可以誘發DNA損傷，甚至染色體異常。

3 H cy與D N A甲基化

Song等[13]檢測21-三體綜合征患兒血Hcy和單核細胞甲基化水平，并與年齡相匹配的正常兒童相比后發現，21-三體綜合征患兒血漿Hcy水平升高，細胞DNA甲基化程度下降[14]。這一證據提示，高水平Hcy引發的低DNA甲基化參與21-三體綜合征的發生。

國外學者收集因CHD和/或21-三體綜合征終止妊娠的患兒心臟和正常人的血液標本，觀察了分布于407個基因上的465個CpG島的甲基化程度，發現CHD和21-三體綜合征胎兒的心肌基因組甲基化程度均顯著低于正常對照組[15]。同時，Chowdhury等[16]的前瞻性研究發現，與生育正常子代的母親相比，母親生育無癥狀CHD者，其基因組中大部分CpG島的甲基化程度下降；同時，作者還鑒定出絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路相關基因MAP4K5和MAPK13為甲基化差異基因。MAPK通路通過調控細胞增殖、分化和遷移參與多種疾病的發生、發展[17-18]。以上證據提示，MAPK通路相關基因的異常甲基化參與了CHD的發生。此外，小鼠透明質酸合酶2（hyaluronan synthase 2,Has2）基因是心內膜發育和瓣膜形成的必需基因。在正常胎鼠妊娠14.5d時（瓣膜發育期），Has2基因表達下調并伴有甲基化增加。如果Has2基因持續高甲基化狀態，將引起流出道細胞過度增殖，從而導致心臟流出道狹窄[19]。因此，DNA甲基化還通過調控靶基因的時空表達參與心臟的正常發育。

異常DNA甲基化還參與NTDs的發生。在小鼠NTDs模型中，全基因組DNA甲基化于胚胎妊娠3.5d開始增加，妊娠6.5d達高峰，整個孕期均維持高甲基化狀態。NTDs小鼠Siah1b和Prkx基因的甲基化程度減少，隨之伴有上述基因表達的增加。據報道，Siah1b可被p53活化，誘導細胞周期阻滯或凋亡[20]；Prkx基因編碼絲氨酸酪氨酸激酶，調控神經元增殖、分化和遷移[21]。葉酸是公認的甲基供體前體，經葉酸治療后小鼠Siah1b和Prkx基因甲基化增多且表達減少，NTDs發生率也明顯下降[22]。

研究發現，Hcy是全基因組DNA甲基化程度的重要調控因子[23-24]。Dominquez-Salas等[25]發現，母親孕期血漿Hcy水平增高，子代來自于中胚層的單核細胞和來自于外胚層的毛發的DNA甲基化均減少；也就是說，母親血漿Hcy水平和子代DNA甲基化程度呈反比。因此，胚胎在基因印跡過程中暴露于高水平Hcy環境，甲基供體不足和DNA甲基化異常，最終誘發多種出生缺陷。

4 H cy與細胞凋亡

胚胎發育過程中，細胞凋亡失常會干擾組織、器官形態建立和功能發揮，從而導致畸形發生。1996年，Rosenquist等[26]首次發現 Hcy能誘發 NTDs，Hcy濃度為 0.5～2.5、5～7.5、10 和 15μM 時，NTDs發生率分別為0%～5%、≤18%、≥30%和≥75%；不僅如此，NTDs發生部位還檢測到明顯的神經細胞凋亡[27]。另外，研究表明，Hcy也可誘導雞胚心臟神經嵴細胞凋亡，繼而導致心臟流出道心肌化減少、流出道墊體積增大和室間隔缺損[28]。以上證據提示，Hcy能夠通過細胞凋亡誘發多種出生缺陷。

Hcy致細胞凋亡的機制如下：（1）氧化損傷：Hcy側鏈上的巰基發生自氧化反應的過程中，產生大量的H2O2、OH-和超氧陰離子（）等活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）。ROS啟動脂質過氧化反應，破壞細胞膜性結構的完整性，誘導細胞凋亡、甚至死亡。在大鼠實驗中，當腦組織和海馬神經祖細胞暴露于高濃度Hcy環境時，MAPK信號通路被活化，活化的MAPK通路抑制下游凋亡因子B淋巴細胞瘤-2基因表達，神經細胞大量凋亡，最終表現為宮內生長遲滯和腦容量減少[29]。（2）內質網應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）：由于各種原因引起的內質網中堆積錯誤折疊/未折疊蛋白或Ca2+平衡紊亂的狀態，即為ERS。劇烈或長程的ERS會激活凋亡程序以除去嚴重受損的細胞。Zhang等[30]研究認為，Hcy誘導臍靜脈內皮細胞死亡，是通過未折疊蛋白聚集引起ERS，而非氧化損傷。蛋白質結構改變，蛋白折疊和分泌受影響，內質網中錯誤折疊蛋白積聚引起ERS，最終誘導細胞凋亡。

綜上所述，Hcy致出生缺陷機制復雜，可能是多種機制共同作用的結果，仍有待前瞻性流行病學調查和進一步的體內外研究。但目前大量研究均表明Hcy與出生缺陷密切相關，這提示監測孕母Hcy水平并予以干預，可早期預防出生缺陷的發生。