幾種稻田固氮藍藻揮發物的氣相色譜-質譜分析

張定煌，周伊薇，李盛安，包江橋，馮敏鈴，賀鴻志

(1.中山市農業科技推廣中心，廣東中山 52840；2.廣東省現代生態農業與循環農業工程技術研究中心，華南農業大學，廣東廣州 510642；3.中山市農產品質量監督檢驗所，廣東中山528401)

固氮藍藻是能進行固氮作用的藍藻的總稱[1]，現已發現的固氮藍藻有150余種，是熱帶亞熱帶地區重要的微生物資源[1-2]。固氮藍藻在生物肥料、生物農藥、功能食品、新藥物、新能源、新材料、污染修復等方面具有廣闊的應用前景。1939年印度首次報道用固氮藍藻肥田，之后許多研究證明稻田接種固氮藍藻可增產[3]。目前隨著對固氮藍藻應用基礎和應用研究方面的發展，其在農業生產中的應用潛力正在得到更全面和深入的認識，而其在農業環境污染修復、農業病蟲害防治、農業廢棄物利用等方面的應用也成為了目前的熱點[2]。固氮藍藻可以產生大量性質各異的次級代謝物，已有部分藻源化合物在醫學方面得到商業化應用，但固氮藍藻可能仍然有天然活性成分尚待發掘和利用。鑒于此，筆者采用氣相色譜-質譜聯用法對5株稻田固氮藍藻產生的胞內胞外揮發性化學成分進行了分析鑒定，以評估其應用潛力。

1 材料與方法

1.1材料試驗所用5株分離自稻田、具有異形胞的絲狀固氮藍藻為Nostocsp.(FACHB-85)、Nostocpaludosum(FACHB-89)、Nostocsp.(FACHB-131)、Anabaenaoryzae(FACHB-604)、Anabaenaazotica(FACHB-119)，均購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫。藻培養試驗采用BG11無氮培養基。所有化學試劑均為分析純，試驗用水為超純水，所用萃取溶劑均為色譜純。

1.2方法

1.2.1藻培養方法。在500 mL玻璃三角瓶中加入BG11無氮培養基200 mL，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，無菌條件下接種10 mL對數生長期的藻種。在光照培養箱、溫度28.5 ℃、光照3 000 lx條件下培養，每天搖瓶3～6次，共培養14 d(對數生長后期)。

1.2.2藻培養液和藻細胞揮發物提取。采用離心法分離藻細胞和培養液，離心獲得上清液，經0.22 μm微孔濾膜過濾后加入20 mL色譜純乙酸乙酯，在搖床上避光振搖1 h。將混合液轉移到250 mL分液漏斗中，靜置，分層后進行分液，保留乙酸乙酯相，加無水硫酸鈉除去水分后，在旋轉蒸發儀上蒸發至干，加色譜純乙酸乙酯定容至2 mL，經0.22 μm微孔濾膜過濾后即可用于氣相色譜-質譜分析。上述離心獲得的藻細胞凍干后，加入20 mL色譜純乙酸乙酯，在搖床上密封避光振搖24 h。經0.22 μm微孔濾膜過濾后，用無水硫酸鈉除水，再經旋轉蒸發至干，加乙酸乙酯定容至2 mL，濾膜過濾后用于分析。

1.2.3氣相色譜-質譜測定條件和方法。HP-5MS毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進樣口溫度：250 ℃；進樣方式：不分流進樣；進樣量：1 μL；柱流速為1.0 mL/min；載氣：高純氦氣；程序升溫：70 ℃保持1 min，以20 ℃/min的速度升溫至220 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速度升溫至280 ℃，保持15 min；質譜條件：離子源230 ℃，四極桿150 ℃；離子源及電壓：EI源70 eV；質量掃描范圍：40～500 m/z；檢索譜庫：NIST14.L。

2 結果與分析

2.1藻細胞培養液中的外泌揮發物分析用色譜純乙酸乙酯萃取獲得了藻細胞培養液中揮發性物質，其代表性的GC-MS分析圖譜見圖1。由圖1可知，胞外液有20多個較大的色譜峰。經質譜分析并進行數據庫匹配后的結果見表1(僅選擇匹配度超過80%的物質)。由表1可知，FACHB-85、FACHB-89、FACHB-131、FACHB-604和FACHB-119確認出現的揮發物分別有11、13、9、7和7個。化合物類型主要包括烷烴類、鹵代烴類、硅烷類、酚類和酯類。其中，2，4-二叔丁基酚、鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二仲丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二(2-乙基己基)酯、鄰苯二甲酸，6-乙基-3-辛基-2-乙基己酯在5株藻的胞外液中均有出現。

圖1 培養液中揮發物代表性色譜圖(FACHB-89)Fig.1 A representative chromatography of volatiles in algal culture filtrate(FACHB-89)

按照色譜峰面積占比，念珠藻FACHB-85和FACHB-89的培養濾液中出現的主要物質均為鄰苯二甲酸，6-乙基-3-辛基-2-乙基己酯，其次為鄰苯二甲酸二丁酯，這2種物質之和分別占2種藻胞外分泌揮發物的94%和85%以上。但同為念珠藻屬的FACHB-131卻與這兩者存在很大差異，而與魚腥藻屬的FACHB-119非常接近，主要物質為鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二(2-乙基己基)酯和2，4-二叔丁基酚。FACHB-604則主要是鄰苯二甲酸二異丁酯，占91.2%。

表1 藻培養濾液中揮發物的氣相色譜-質譜分析結果

2.2藻細胞中的揮發物分析用色譜純乙酸乙酯萃取獲得了藻細胞中的揮發性物質，其代表性的GC-MS分析圖譜見圖2。由圖2可知，細胞提取液也有20多個較大的色譜峰。經質譜分析并進行數據庫匹配后的結果見表2(僅選擇匹配度超過80%的物質)。由表2可知，FACHB-85、FACHB-89、FACHB-131、FACHB-604和FACHB-119確認出現的揮發物分別有10、9、11、9和7個。化合物類型主要包括硅烷類、烷烴類、酯類和酰胺類，這與培養液中的結果有較大的差別。

圖2 藻細胞中揮發物代表性色譜(FACHB-131)Fig.2 A representative chromatography of volatiles in algal cells(FACHB-131)

2.3藻產揮發物活性成分應用潛力評估將試驗獲得的揮發性物質進行了進一步分析以評估可能的活性成分，結果見表3。由表3可知，國內外研究已經證實的活性物質主要包括烷烴類、酚類、脂類和硅烷類共計9種物質。其中烷烴類為十七烷和7-甲基-十七烷，兩者均具有抗病原微生物的作用[4]，而7-甲基-十七烷可以作為性信息素[7]。酚類為2，4-二叔丁基酚，具有抗植物病害、抑制有害生物膜、抗草、抗菌、抗氧化、殺蟲等多重作用[8-17]，特別是近年來其在破壞有害生物膜方面的作用引起廣泛關注[8-11]。在酯類方面，其主要的活性作用為抑制有害藻類，如水華藻微囊藻和赤潮藻短凱倫藻[18-21]。同時，部分具有抗作物病害的作用[22-25]。而鄰苯二甲酸，6-乙基-3-辛基-2-乙基己酯甚至具有一定的抗蟲作用[26]。這都說明雖然作為塑化劑的主要成分的鄰苯二甲酸酯類物質被認為是環境污染物質，但在某些條件下可作為生物源殺藻劑和農藥使用。已經有研究表明，很多淡水藻類均能產生鄰苯二甲酸酯類物質，可以在脅迫條件下釋放到環境中[27]。此外，硅烷中十八甲基環九硅氧烷被認為可能具有抗菌活性[23]。

表2 藻細胞中揮發物氣相色譜-質譜分析結果

表3 藻產揮發物活性成分應用潛力評估

3 結論

采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)分析方法對5株稻田固氮藍藻的揮發性化學成分進行分析與鑒定。結果表明，固氮藍藻揮發性成分中有多種生物活性功能的烷烴、酚類和酯類物質，具有抗動植物病原微生物、抑制有害藻類、抗草、殺蟲等作用，說明稻田固氮藍藻在生物源藥物、殺藻劑和農藥等生產方面具有應用價值。

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