激素性骨質疏松癥發病機制的研究進展

余佩沅 任輝 沈耿楊 張志達 余翔 黃錦菁 招文華 尚奇 梁德 楊志東 江曉兵*

1．廣州中醫藥大學，廣東 廣州 5104052．廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405

糖皮質激素(glucocorticoid，GC)在臨床疾病的廣泛應用，據統計，1%的美國人長期使用GC進行治療，然而長期使用GC具有明顯的副作用，超過10%長期使用GC的患者被診斷為骨折，而且伴有明顯的骨量流失，導致激素性骨質疏松癥(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)的發病率逐年上升，在骨質疏松癥中其發病率居于第三位，僅次于絕經后骨質疏松及老年性骨質疏松[1]。GIOP是一種由GC所引起的以骨量減少，骨的微細結構破壞，骨的脆性增加為特征，從而容易發生骨折的全身性骨病[2]。本文就GIOP的發病信號通路研究進行綜述，以尋求更好的靶向治療途徑。

1 GIOP經典的發病信號通路

GC介導的骨質疏松癥的形成途徑主要通過抑制骨形成信號通路調控蛋白或促進骨吸收信號通路調控蛋白的合成或釋放，最終造成骨量的流失。

GC 抑制 Wnt 信號通路，從而抑制骨形成。Wnt 信號通路與一些蛋白質的相互作用密切相關，對各種細胞和組織的發育和功能具有重要作用[3,4]。越來越多的證據[5,6]表明：Wnt/β-catenin信號通路也是控制成骨細胞(osteoblast，OB)代謝方面的重要分子機制之一，是成骨形成的必要條件。然而研究證明，GC 通過上調Wnt 抑制因子 DKK-1 和 sclerostin 的表達，激活GSK-3β和使 β-catenin 失去穩定性，衰減 Wnt 信號通路，下調OB Wnt 信號通路，從而抑制 Wnt/ β-catenin 經典途徑。

RANKL由OB分泌，其結合并激活位于破骨細胞(osteoclast，OC)前體表面的受體RANK，誘導破骨的形成。OPG 則是 RANKL的天然抑制劑，能夠抑制 RANKL 與OC上受體RANK 結合[7,8]。研究表明，GC不僅能促進OC生成和抑制 OPG 產生，并且刺激OB譜系產生OPG受體，與 RANKL 競爭OPG，從而促進骨的吸收導致骨量減少，骨強度降低。另有研究[9-11]結果表明hRANKL 敲除老鼠，通過抑制RANKL系統能防止激素性骨量減少和強度下降。

BMPs是誘導非成骨細胞分化為成熟成軟骨細胞、OB的關鍵蛋白，對促進新生骨和軟骨形成有重要[12,13]。GC可以拮抗BMP-2促進OB分化成熟、誘導軟骨和新生骨形成的過程[14]。另有研究[15]發現GC可以通過影響BMP下游>50 kb的編碼序列而抑制BMP的轉錄，且對BMP-2和BMP-4的抑制作用更為明顯。

GC作用于骨代謝分子信號通路已經有一定的研究，除了上述所報道的分子信號通路以外，對于GIOP經典研究還包括PTH、Hippo、NF-κB、IGF-1通路等，在此不再作詳細描述。

2 GIOP通路機制的研究進展

近年來，自噬相關信號通路已被證實在OB分化或OC退變過程中起到重要作用，而非編碼RNA作為通路的調節因子和新型標志物，可作為GIOP發病機制研究另一新方向。

2.1 自噬

自噬是指一個吞噬或降解自身細胞質蛋白或細胞器，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新的過程[16]。人體隨著年齡增長，體內自噬水平不斷下降，這是年齡增長造成骨強度下降的一個原因[17]。mTOR在上游影響自噬誘導階段負性調控自噬水平，而自噬通過參與調節OC的活性而調節骨吸收，mTOR 通路的抑制會促進自噬，同時mTOR的抑制可以降低OC的活性，減少OC數量mTOR是負性調控自噬水平的主要信號通路，自噬通過參與調節OC的活性而調節骨吸收，同時通過抑制mTOR以調節OB分化促進骨形成。而LC3、Beclin1蛋白是典型的自噬體的標志物[18]。

高水平的GC對OC的自噬有促進作用，GC誘導后OC的LC3-I和LC3-II的表達增加，同時對負向調控自噬水平的AKT、p70S6K mRNA的表達有明顯抑制作用[19]。 研究GC對OB自噬水平的影響發現，低水平的GC對OB的自噬有一定促進作用，高水平的GC對OB的自噬是有抑制作用[20]。

通過上述可見GC對OB的自噬作用與濃度相關，生理劑量的GC作用于OB與OC，相互之間拮抗，保持骨量的平衡。如GC超過生理劑量，骨代謝則會失衡，OC自噬水平的增加，OB自噬減少是引起骨強度下降的一個重要原因。

也有研究[21]發現，GC能夠影響BMSCs的增殖分化，而BMSCs體內自噬的作用有助于BMSCs增殖和防止凋亡，是應對GC造成骨量流失的重要途徑。目前針對自噬與GIOP之間關系的研究已經取得了一定的進展。其具體通路機制復雜，還未能完全闡明，但是研究顯示，自噬的作用影響了GIOP的發病、治療的各個階段，若加以研究，自噬途徑將在預防和治療GIOP領域發揮巨大作用。

2.2 非編碼RNA

非編碼RNA家族作為一種新型的通路調控因子，參與調節細胞的增殖、分化及代謝等生理過程，也參與調節機體的各種病理過程，對骨代謝過程有著重要影響作用。

2.2.1miRNA

miRNA是長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于真核生物中，每個miRNA可以有多個靶基因，而若干個miRNA也可以調節同一個基因，通過這樣的復雜調節網絡而影響細胞增殖、分化及凋亡。Runx2 和其下游Osterix是miRNA的作用靶點，miRNA通過與其相互作用而調節骨代謝[22]。Runx2是促進OB分化和骨質形成的重要因子，其可促進骨鈣素、堿性磷酸酶(ALP)等促成骨因子表達。Osterix(OSX)是繼Runx2后發現的促進OB分化的另一重要因子。且miRNA水平能反應BMSCs 分化作用，部分miRNA在BMSCs向OB分化過程中表達減少[23]。

有研究[24]發現在GIOP動物模型中的miRNA表達發生了顯著變化，以 miR-672-5p的上調和miR-146 a-5p的下調最為明顯，這表明它們有可能參與骨代謝的調節。在體外實驗方面，miR-106b在體外能負向調控BMSCs的分化，抑制OB成熟分化，且在GIOP模型小鼠中表達增加[25]。GC可誘導OC分化且抑制了miR-338-3p的表達，增加骨吸收，且這可能與RANKL通路有所關聯[26]。而Liang等[27]發現，miR-124可以減少GC受體的表達，從而阻止了GC對骨形成的抑制作用。另外，GC也能下調miR34 a表達[28]，而miR34 a能通過靶基因對骨代謝、干細胞增殖與分化、OB、OC的增殖與分化、細胞周期及細胞凋亡與自噬等均具有重要調控作[29]。這些基礎實驗研究表明，miRNA作為一種重要的通路調控因子，無論從成骨還是破骨通路，miRNA都能從中影響骨代謝，而且在GC的調控下，不少的miRNA都有不同的上調或下調，而通過對這些特異性 miRNA 的不斷發現和深入研究，為今后開展更多miRNA相關臨床實驗打下堅實的基礎。

而在臨床方面，已有學者發現在激素性股骨頭壞死的患者血漿中，miR-1207-5p和miR-887的表達明顯上調，明顯下調的是miR-96-5p和miR-576-5p，這說明miRNA在GC影響骨代謝當中起了一定作用，那么在GIOP患者血清中這些miRNA是否也存在上調或下調呢？這也是值得我們以后思考和研究的。

miRNA的種類繁多，且調控網絡復雜，但miRNA特異性較高，可作為新的生物學標記，若加以研究，深入認識其生物學效應，更好地幫助研究GIOP的發病機制，并可能提出新的診斷依據，為該病的靶向治療提供一個全新的技術平臺。由于現階段我們對miRNA 的認識和研究還十分有限，對于數目龐大未知的特異性miRNA，我們需要努力去探索；對于已知的特異性miRNA還要繼續深入研究，明確其功能、調控機制、作用靶點、作用劑量、活性因素、表達時序性及不同miRNA在同一生命過程中相互之間的聯系對靶向治療GIOP必有重大幫助。

2.2.2lncRNA

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是指長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，lncRNA不止在遺傳信息中承擔載體的角色，而且更多地承擔了對細胞周期、分化的調控功能，從而對骨代謝形成重要作用。

Tong等[30]發現骨質疏松患者中的lncRNA-DANCR表達呈現高表達，同時DANCR對TNFα、IL-6等影響OC的炎癥因子的表達有促進作用。Li等[31]在骨質疏松大鼠模型發現lncRNA-H19可以通過抑制Wnt信號通路，進一步促進Dkk-4的表達，從而抑制骨形成。

雖然lncRNA已被證實在動物模型的骨代謝過程中有一定的調控作用，但對lncRNA的研究仍處于起步階段，仍需大量的基礎及臨床相關實驗去證實lncRNA對骨代謝影響的作用，且目前對lncRNA與GIOP的靶向研究仍較缺乏，GC對lncRNA影響的需要進一步研究。

3 通路間的交聯反應(crosstalk)

各信號通路和調節因子已被證實對GIOP的形成有著重要作用，而隨著信號通路研究的不斷深入，發現各通路或調節因子之間有相互聯系的，因為細胞不是一個獨立的個體，每個細胞之間都可以通過發送信號進行細胞間的交流，而且細胞間可以通過幾個不同信號系統進行相互聯系，細胞間通過這種“串話”可以調節細胞的生物反應，從而影響機體發育和調節體內平衡。

3.1 Wnt與其他通路的交聯

上文提到Wnt信號在影響骨形成方面有重要作用，而研究發現，Wnt/β-catenin與OPG/RANKL/RANK兩通路在影響骨代謝作用中是有相互“串話”， GC可以通過抑制Wnt信號通路的β-catenin來下調OPG的表達，從而誘導RANKL的生成，而Dkk-1作為Wnt/β-catenin信號的負向調控因子，在GIOP模型中也可以通過抑制BMSCs向OB分化，進一步減少OPG的表達，上調RANKL/OPG的比例，促進骨吸收[32]。

另外，Wnt/β-catenin與BMP拮抗GIOP骨量流失過程中通路間也是有相互聯系的，Wnt可以促進BMSCs不斷分化，成為成骨前體細胞，由于Wnt信號的作用，可以不斷維持細胞的前體狀態，而BMP卻有促進成骨前體細胞分化為成熟的OB，雖然它們對成骨前體細胞有著相反的作用，但是一旦成骨前體細胞分化成為成熟的OB，Wnt與BMP之間發生協同作用，促進OB進一步成熟分化，分泌ALP，加強骨形成。可見Wnt與BMP之間在骨形成的不同階段分別發生拮抗或者協同作用[33]。

Hippo信號通路也是影響骨代謝的一個重要通路，TAZ (transcriptional co-activator with PDZ-binding motif) 是 Hippo信號下游的一個激活因子。研究發現，GC可以促進TAZ的表達，且TAZ對Wnt/β-catenin通路有抑制作用，通過促進β-catenin的磷酸化降解，抑制catenin轉位入核與啟動靶基因的結合，從而抑制了骨形成[34]。

雖然Wnt/β-catenin作為經典的骨代謝通路，已經有大量的基礎和臨床相關的研究，但Wnt/β-catenin通路靶向因子多，與其他通路關鍵因子的crosstalk調控網絡復雜，在未來仍有一定的研究潛力。

3.2 自噬與其他通路的交聯

高燕等[35]探討了自噬與BMPs間的關系，發現BMP-2能有效促進細胞株C2C12、MC3T3-E成骨分化，成骨分化指標ALP、SP7等增高，與此同時，自噬標志物LC3-Ⅱ和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ反映的自噬水平也隨著成骨分化而先增強后減弱。而3-甲基腺嘌呤(3-Methyladenine，3-MA)是一種不依賴mTOR通路的自噬抑制劑，當其作用在C2C12、MC3T3-E細胞時，隨著水平增高，細胞成骨分化明顯受抑制，ALP的表達降低，而這很可能是BMP-2受體被阻斷所造成的。

另有學者也研究了自噬與OPG/RANKL/RANK通路之間的相關聯系，利用RANKL誘導小鼠巨噬細胞RAW264.7分化為成熟OC，而在此過程中自噬相關標志物LC3-Ⅱ表達增多，這表明自噬參與了RANKL所誘導的破骨分化過程[36]。

可見自噬在成骨和破骨的通路調控中都有一定作用，但由于3-MA可能存在著非特異性，若能對其自噬相關基因進行敲除研究，可以提供更明確的證據。

3.3 miRNA與其他通路的交聯

miRNA作為一種新型的調控因子，也參與和其他信號通路的“串話”，研究[37]發現，GC促進miR-214的表達，且利用BMP-2誘導BMSCs成骨分化的過程中，miR-214作為OSX通路的抑制劑參與了調節，抑制了OB形成。miR-29 a通過Wnt信號通路促進OB分化，加強骨細胞形成，能有效拮抗GC所造成的骨量流失[38]。細胞成骨分化過程中，發現miR-27通過激活與骨形成關系密切的Wnt信號通路促進hFOB1.19的成骨分化。證實了腺瘤性結腸息肉病蛋白(APC) 為miR-27的靶基因。APC通過作用其靶點β-catenin，涉及對 Wnt 信號通路的調控。miR-27通過抑制APC表達，促進β-catenin的高表達，從而正向調控了成骨分化[39]。

miRNA和自噬對細胞的調控對維持人體骨量平衡有重要作用，miRNA能夠調節包括自噬在內的許多細胞進程，而細胞的自噬在維持miRNA內環境穩定發揮一定作用，兩者之間有一定的聯系[40]。You等[41]研究發現，miR-378的過度表達可以抑制成骨分化，而這很可能是通過自噬相關通路PI3K-Akt所完成的。而Sun等[42]也發現miR-20 a能作用于巨噬細胞時，能明顯下調LC3、Beclin1等自噬相關標志物的表達，可見兩通路間的交聯對調控骨代謝有一定作用，但兩者之間的“串話”對GIOP的形成機制仍不明確。

4 小結

尋找GIOP相關分子信號通路上的作用靶點并進行相關的靶向治療，是有效防治GIOP的重要途徑。目前對GIOP的發病相關分子信號通路的研究不斷深入，從最開始的Wnt/β-catenin、OPG/RANKL/RANK等經典信號，到近年來對自噬、非編碼RNA和crosstalk的研究。各個通路間相互聯系，相互作用，共同構成了調控GIOP發病的信號網絡。然而，我們目前的研究層面很可能只是這個復雜的調控網絡中的冰山一角，許多通路和調節因子的研究仍處于起步階段，大部分通路研究也僅局限于單一信號通路，雖然現有研究證實部分通路間的crosstalk能夠調控GIOP的發生，但具體機制很多仍未闡明。

但是，由于信號通路的作用位點明確，而針對信號通路的靶向治療效果也更精確。因為通路間并非是完全獨立的，這使得未來GIOP的治療變得更加復雜。為獲得更為有效、安全的GIOP靶向治療藥物，針對目前的研究現狀，仍需要更多的基礎及臨床實驗研究，探究各種新型靶向藥物之間的相互作用，為臨床實踐提供更多可靠的偱證醫學證據。