HPLC法測定羅漢膏中羅漢果皂苷V的含量

張慶蓮 皮鳳娟 黃娟

摘要：目的 建立羅漢膏中羅漢果皂苷V的高效液相色譜測定方法。方法 采用高效液相色譜法，色譜柱為Agilent SB-C18（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈-水（22：78），檢測波長為203 nm，柱溫為30℃，流速為1.0 mL/min。結(jié)果 羅漢膏中的羅漢果皂苷V線性關(guān)系良好（范圍：0.1954～3.908μg，r=0.9999），加樣回收率平均為100.08%，RSD為2.16%。結(jié)論 所建方法簡便、快速，可用于羅漢膏中羅漢果皂苷V的含量測定。

關(guān)鍵詞：羅漢膏；羅漢果皂苷V；高效液相色譜法

中圖分類號：R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1007-2349（2018）10-0057-03

【Abstract】Objective：To establish a high performance liquid chromatographic method for the determination of mogroside V in Luohan Ointment. Methods：High performance liquid chromatography was used. The column was Agilent SB-C18（250 mm×4.6 mm，5μm），the mobile phase was acetonitrile-water（22：78），the detection wavelength was 203 nm，the column temperature was 30°C，and the flow rate was 1.0 mL/min. Results：The Mogroside V in Luohan Ointment has a good linearity at the range of 0.1954 to3.908μg，r=0.9999. The average recovery rate was 100.08% and the RSD was 2.16%. Conclusion：The method is simple and rapid，and can be used to determine the content of mogroside V in Luohan Ointment.

【Key words】Luohan Ointment，mogroside V，high performance liquid chromatography

羅漢膏為瀘州市中醫(yī)醫(yī)院開發(fā)研究的醫(yī)院中藥制劑，主要由羅漢果、百合、魚腥草等藥味組成，具有清熱潤肺，化痰止咳功效，常用于治療肺熱型咳嗽，且藥物均為藥食兩用，有很好的藥用效果和保健作用。其君藥羅漢果具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、增強(qiáng)免疫等多種活性，并且近年來羅漢果也被開發(fā)成多種產(chǎn)品上市[1-3]。為了保證羅漢膏的質(zhì)量穩(wěn)定可靠，對君藥羅漢果的主成分羅漢果皂苷V的含量進(jìn)行測定[4，5]，并進(jìn)行方法學(xué)驗證，為羅漢膏的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫1260高效液相色譜儀（美國安捷倫有限公司），F(xiàn)A2004型萬分之一電子天平（上海安亭電子儀器廠），SOP型十萬分之一電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司），CQ-250A-DST型超聲波清洗器（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠），HH型數(shù)顯恒溫水浴鍋（金壇市金城國勝實驗儀器廠）。

1.2 試藥 羅漢果皂苷V（批號：111754-201502，供含量測定用），為中國食品藥品研究院提供。羅漢膏為本院制劑室提供；乙腈為色譜純，水為超純水，甲醇、乙醇等試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent SB-C18（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈-水（22：78）；檢測波長為203 nm；柱溫為30℃；流速為1.0 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；理論塔板數(shù)按主成分羅漢果皂苷V計算應(yīng)不低于3000。

2.2 對照品溶液的制備[6] 精密稱取羅漢果皂苷V對照品適量，加流動相乙腈-水（22：78）溶解并制成1 mL含0.2 mg的溶液，作為羅漢果皂苷V對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取羅漢膏成品5 g，置于具塞錐形瓶中，加乙醇25 mL，塞好蓋子，稱定重量，加熱回流1 h，冷卻后，稱定重量，加乙醇補(bǔ)足加熱回流減失的重量，搖勻，用濾紙過濾。精密吸取5 mL續(xù)濾液，水浴揮干，殘渣加流動相溶解并定容至10 mL，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，作為羅漢膏的供試品溶液。

2.4 陰性溶液的制備 精密稱取缺羅漢果的陰性制劑5 g，按照“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，作為缺羅漢果的陰性對照溶液。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 精密吸取羅漢果皂苷V對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液各10μl，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)行HPLC測定[7]。結(jié)果表明，分離度良好，缺羅漢果的陰性對照溶液在主成分峰位處無干擾（見圖1）。

2.6 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取羅漢果皂苷V對照品溶液1、2、4、8、10、16、20μl，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)行HPLC測定，以進(jìn)樣質(zhì)量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=212.7X-2.684（r=0.9999），說明羅漢果皂苷V在0.1954～3.908μg范圍內(nèi)線性良好。

2.7 精密度試驗 精密吸取羅漢果皂苷V對照品溶液10 μL，按“2.1”項下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，RSD為1.00%，結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.8 重復(fù)性試驗 精密稱取同一批號的羅漢膏6份，每份5 g，按照“2.3”項下的制備方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件分別精密吸取10 μL進(jìn)樣測定，計算羅漢果皂苷V的含量，含量的RSD為1.56%，結(jié)果表明，測定方法的重復(fù)性良好。

2.9 穩(wěn)定性考察 精密吸取同一批號的供試品溶液，在不同時間0、2、4、6、8h，按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，RSD為1.57%，結(jié)果表明，羅漢膏供試品溶液放置8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.10 加樣回收率試驗 精密稱取已知羅漢果皂苷V 含量的羅漢膏6份，分別加入適量的羅漢果皂苷V對照品溶液，按“2.3”項下方法制備，分別精密吸取10μl按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

由表1可知，羅漢果皂苷V的平均加樣回收率為100.08%，六份加樣回收率均在95%-105%之間，且RSD<3%，說明方法的準(zhǔn)確度良好。

2.11 耐用性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，分別改變溫度±5℃，改變流動相比例±5%，改變色譜柱為Kromasil 100-5C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），按“2.1”項下的色譜條件進(jìn)樣測定，計算羅漢果皂苷V的含量，結(jié)果三種條件下測定的含量RSD均小于1，表明該方法耐用性良好。

2.12 樣品含量測定 分別精密稱取中試生產(chǎn)的三批樣品（批號為20161101，20161102，20161103）5 g按照“2.3”項下方法制備樣品溶液，按“2.1”項下的色譜條件精密吸取10μl進(jìn)樣測定，記錄峰面積，計算羅漢果皂苷V的含量，結(jié)果見表2。

3 討論

在羅漢果皂苷V含量測定中，供試品溶液制備方法分別考察了過AB-8樹脂柱洗脫、乙醇回流、甲醇回流、乙醇超聲、甲醇超聲等方法，結(jié)果表明，乙醇超聲制備出的樣品存在含量不均的現(xiàn)象，其余幾種方法提取結(jié)果差異不大。從節(jié)省制樣時間及試劑毒性大小多方面考慮，最后選擇制備樣品的方法為乙醇回流提取。

本試驗比較了甲醇-水、乙腈-水等比例條件下對樣品中羅漢果皂苷V分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈-水（22：78）洗脫時羅漢果皂苷V能得到良好的分離。

在含量測定方法學(xué)研究過程中，發(fā)現(xiàn)室溫對樣品分離度影響較大，故在測定樣品時注意控制室內(nèi)溫度。

羅漢膏是瀘州市中醫(yī)醫(yī)院根據(jù)治療咳嗽的經(jīng)驗，摸索出治療肺熱型咳嗽的經(jīng)驗方制成的煎膏劑，便于攜帶和服用，為肺熱型咳嗽疾病提供一種新的制劑。本研究采用外標(biāo)法測定君藥羅漢果的主成分羅漢果皂苷V，對羅漢膏的質(zhì)量控制進(jìn)行含量測定研究，根據(jù)研究結(jié)果對三批中試生產(chǎn)的羅漢膏成品進(jìn)行含量測定，結(jié)果穩(wěn)定可靠，為該制劑的質(zhì)量評價提供了科學(xué)的理論依據(jù)。

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