microRNA—21調控成骨細胞增殖和凋亡的相關研究

汪凱文 陳德慶

【摘 要】目的：探究microRNA-21對成骨細胞增殖和凋亡的作用。方法：應用PCR技術檢測轉染后的成骨細胞中microRNA-21的表達水平；應用CCK-8實驗檢測microRNA-21對成骨細胞增殖能力的影響；應用TUNEL實驗檢測microRNA-21對成骨細胞凋亡的影響。結果：PCR結果顯示，轉染microRNA-21 mimics后，成骨細胞中microRNA-21的表達顯著升高，而轉染microRNA-21 AMO后，成骨細胞中microRNA-21的表達顯著降低；CCK-8實驗結果表明，microRNA-21 能夠顯著升高成骨細胞增殖能力；TUNEL結果表明，microRNA-21能夠抑制成骨細胞發生凋亡。結論：microRNA-21能夠顯著升高成骨細胞增殖能力，并抑制其發生凋亡，從而可能參與骨質疏松的發生和發展。

【關鍵詞】miRNA；骨質疏松；成骨細胞；增殖；凋亡

【中圖分類號】R968 【文獻標識碼】A 【文章編號】1005-0019（2018）20-0-01

骨質疏松癥（Osteoporosis，OP）是一種以骨密度降低、骨微觀結構受損、骨量減少、骨強度下降，引起骨脆性及分離度增加的全身代謝性骨骼疾病[1]。骨質疏松患者容易出現胸廓畸形、骨痛和駝背等癥狀，嚴重時將發生骨折[2]。骨質疏松的主要發病原因之一是破骨細胞性骨吸收與成骨細胞性骨形成平衡失調[3]。因此，成骨細胞在維持骨平衡和骨代謝中發揮重要功能。MicroRNAs（miRNAs）是一類存在于所有真核細胞、由大約22個核苷酸組成的非編碼RNA，具有組織特異性和發育階段特異性[4]。miRNAs通過和其靶點mRNA特異性結合，使其降解或抑制其翻譯，從而調控基因的表達，最終在細胞增殖、分化、凋亡、個體生長發育及疾病的發生與發展等方面發揮重要調控作用[5]。本研究探究microRNA-21對成骨細胞增殖和凋亡的影響，并尋找治療骨質疏松的關鍵microRNA，為臨床治療骨質疏松提供新的靶點和方向。

1 材料與方法

1.1 材料 二氧化碳恒溫培養箱（Thermo，美國），倒置光學顯微鏡（Nikon，日本），microRNA-21及陰性對照、所有引物設計和合成（吉瑪，中國廣州），逆轉錄儀、PCR儀（羅氏，德國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：人成骨細胞系MC3T3-E1采用含10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL的青-鏈霉素的α-MEM培養液中培養，并接種于25 cm2的細胞培養瓶后置于37 ℃培養箱中培養（Thermo公司，美國）。培養24 h后置于倒置光學顯微鏡（Nikon公司，日本）下觀察細胞，待細胞匯合度達到80%-90%時進行細胞傳代，傳代比例一般為1：2或1：3。

1.2.2 細胞轉染：將細胞接種于小皿或96孔板中，當細胞匯合度達到50%-60%，采用細胞轉染試劑X-treme進行轉染。microRNA-21 mimics和microRNA-21 AMO轉染濃度分別為50 nM和100 nM。轉染6 h后更換含有10%胎牛血清的新鮮培養液以維持細胞正常生長，轉染24 h后進行后續實驗。

1.2.3 PCR檢測microRNA-21的表達：應用TRIZOL提取樣品中總RNA，測定濃度和純度，待用。參照逆轉錄試劑盒說明書，使用逆轉錄儀將RNA逆轉錄成cDNA，保存于-20℃，待用。在PCR板中分別加入10 μL的SYBR Green，7 μL蒸餾水，2 μL目的基因的引物及1 μL cDNA，總體系為20 μL，在PCR儀上進行PCR擴增。根據CT值，計算microRNA-21的表達情況。

1.2.4 CCK-8實驗：將96孔板中的培養液棄凈，每孔加入100 μL無血清單純培養基，并加入10 μL的CCK-8試劑，呈“十”字輕輕晃動培養板，充分混勻后，避光置于細胞培養箱中，孵育4 h后，采用酶標儀檢測各組細胞的吸光度值，并計算增殖能力。

1.2.5 TUNEL染色：成骨細胞以1×105/cm2密度接種到小皿中，待細胞匯合度達到40%-50%時，進行轉染或加藥48 h后，4%多聚甲醛固定細胞后，室溫下用穿透液于穿透細胞60 min，PBS清洗三次后加入TUNEL反應混合液，在37 ℃避光濕盒中搖床孵育1 h。PBS漂洗3次后，用封閉液封閉20 min，PBS清洗細胞3次后，用染色液4 ℃搖床孵育過夜。次日，用DAPI染色液孵育20 min，顯微鏡下觀察細胞，并統計結果。

1.3 統計學處理 所有數據均采用Graphpad軟件進行統計學處理，并分析差異是否具有統計學意義，*p < 0.05，**p < 0.01和 ***p < 0.001，具有統計學意義。

2 結果

PCR結果顯示，轉染microRNA-21 mimics后，成骨細胞中microRNA-21的表達顯著升高，而轉染microRNA-21 AMO后，成骨細胞中microRNA-21的表達顯著降低，說明轉染效率較高；CCK-8實驗結果表明，轉染microRNA-21 mimics后，成骨細胞增殖能力顯著升高，而轉染microRNA-21 AMO后，成骨細胞增殖能力顯著降低；TUNEL染色結果說明，轉染microRNA-21 mimics后，成骨細胞凋亡比例顯著降低，而轉染microRNA-21 AMO后，成骨細胞發生凋亡的比例顯著升高，說明microRNA-21抑制細胞發生凋亡。

3 討論

骨質疏松癥（ Osteoporosis） 是一種以骨量減少，骨微結構破壞，導致骨脆性增加，骨折危險性增加為特征的全身性代謝骨病。防治骨質疏松癥及其并發癥已逐漸成為骨科領域亟待解決的嚴重問題之一。骨組織是重要的結締組織，起著支撐身體以及保護內臟器官的作用。正常生理條件下，骨微環境中骨組織會發生重建，主要是成骨細胞介導的骨形成與破骨細胞介導的骨吸收，正常情況下，這兩者處于動態平衡。骨重建過程中的這種平衡被打破將會引起人體病理生理改變，骨質疏松的發病原因是骨吸收速率增加，使骨形成少于骨吸收，最終導致骨總量降低。因此，如何提高成骨細胞生物學功能是治療骨質疏松的重要靶點。

綜上所述，microRNA-21能夠顯著升高成骨細胞增殖能力，并抑制其發生凋亡，從而可能參與骨質疏松的發生和發展。本研究為臨床治療骨質疏松提供新的靶點和思路，為microRNA應用于治療骨質疏松提供實驗基礎。

參考文獻

王愛飛，王亮，and 徐又佳，MicroRNAs對骨質疏松癥發病機制的研究進展.中國骨質疏松雜志，2018（1）： p.135-140.

倪夢杉，et al.，治療骨質疏松和骨折何時聯用或介入抗骨質疏松治療.中國組織工程研究，2018.22（4）： p.625-630.