BIN1基因多態性與中國福建東南部地區阿爾茨海默病患者的關聯研究

劉祺 李劍鵬 畢敏

【摘要】 目的：探討BIN1基因單核苷酸多態性與中國福建東南部地區阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）患者的關聯性。方法：選取中國福建東南部地區AD患者110例（AD組）和正常對照人群123例（正常對照組），均提取其外周血DNA運用多重突變擴增系統檢測載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）基因型，同時采用傳統Sanger測序對BIN1基因單核苷酸多態位點rs7561528進行檢測，分析不同基因型與AD的關聯性。結果：兩組在BIN1基因多態位點rs7561528的基因型頻率（GG、AG、AA）和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。結論：BIN1基因多態位點rs7561528可能與中國福建東南部地區AD患者無明顯關聯性。

【關鍵詞】 阿爾茨海默病； BIN1基因； 單核苷酸多態性； 中國福建東南部

【Abstract】 Objective：To investigate the relevance between the BIN1 gene and the patients with Alzheimers disease（AD） in Southeast Fujian province of China.Method：A total of 110 AD patients（AD group） and 123 normal controls（normal control group） in Southeast Fujian province of China were selected.The apolipoprotein E（APOE） genotype was determined by the multiplex amplification refractory mutation system polymerase chain reaction.Moreover，the single nucleotide polymorphism rs7561528 in BIN1 gene was detected by Sanger sequencing，and the correlation between different genotypes and AD was analyzed.Result：The genotype frequencies（GG，AG，AA） and allele frequencies at the BIN1 gene polymorphism site rs7561528 between two groups were compared，the differences were not statistically significant（P>0.05）.Conclusion：There is no association between rs7561528 polimorphism in BIN1 gene and AD patients in southeast Fujian province of China.

【Key words】 Alzheimers disease； BIN1 gene； Single nucleotide polymorphism； Southeast Fujian province of China

First-authors address：First Affiliated Hospital of Xiamen University，Xiamen 361003，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.31.012

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是癡呆最常見的類型，其臨床表現為隱襲性起病、進行性、不可逆的記憶和認知功能障礙[1]。根據是否具有家族聚集性將AD分為家族性AD（Familial Alzheimers disease，FAD）和散發性AD（Sporadic Alzheimers disease，SAD），其中發病年齡>65歲的晚發型AD（Late onset Alzheimers disease，LOAD）占SAD發病的95%[2]。SAD的病因尚不明確，既往研究證實，載脂蛋白E（Apolipoprotein E，APOE）ε4等位基因與LOAD發病相關[3]，攜帶APOE ε4雜合子可以增加LOAD風險3倍，攜帶APOE ε4純合子則可增加LOAD風險15倍[4]。在既往大規模全基因組關聯分析（Genome-wide association study，GWAS）研究中發現，BIN1基因、CR1基因、GLU基因、PICALM基因、CD2AP基因、SORL1基因也與LOAD致病具有相關性[5-7]，他們是產生AD特征性病理改變神經原纖維纏結和神經炎性斑的重要危險因素。目前BIN1基因是僅次于APOE影響LOAD易感性的遺傳因素，Lambert等[8]最早發現BIN1基因上多態位點rs7561528可能提高LOAD的發病風險，這個結果在多項高加索人群的獨立研究和中國北方漢族AD人群中得到驗證。本研究進一步探討BIN1基因單核苷酸多態性與中國福建東南部地區AD患者是否具有關聯性。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月-2018年1月

就診于本院的中國福建東南部地區AD患者110例為AD組，均進行神經系統檢查、神經影像檢查（顱腦磁共振）和簡易智力狀態檢查量表（MMSE）評估。納入標準：根據《精神疾病診斷與統計手冊》、美國國立神經病語言障礙卒中研究所和AD相關疾病協會診斷標準（NINCDS-ADRDA）進行AD診斷。排除標準：血管性認知功能障礙、路易小體癡呆、額顳葉癡呆和其他可以導致認知障礙的神經科疾病或其他并發癥。同期選取同地區社區中的123例健康正常人群為正常對照組，均進行神經系統檢查和MMSE量表評估。兩組臨床評估均由

2個或2個以上高年資神經內科專科醫師進行。本研究通過廈門大學附屬第一醫院倫理委員會討論批準，所有參與者均由本人或者代理人簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 APOE基因檢測 采用血液基因組DNA提取試劑盒（Tiangen，China）提取參與者外周血基因組DNA。設計5條引物運用多重突變擴增系統檢測APOE基因型[9]，引物序列見表1。

1.2.2 BIN1基因多態位點檢測 本研究采用Sanger測序方法檢測BIN1基因rs7561528變異位點，引物由上海生工公司設計合成。實驗步驟如下，（1）PCR反應：PCR反應為15 μL體系，包含10 μmol/μL的上下游引物、2×Taq Mix（Tiangen，China）、DNA模板和ddH2O。反應條件為94 ℃預變性2 min，30個循環的94 ℃變性30 s，62 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃再延伸5 min；（2）PCR產物純化：將PCR產物置于PCR儀中，37 ℃反應60 min，85 ℃反應15 min；（3）測序反應：將純化產物96 ℃預變性1 min，26個循環的96 ℃變性10 s，50℃反應5 s，60 ℃反應4 min，最后4 ℃反應4 min；（4）酒精純化：將經過測序反應的產物中加入2.5 μL EDTA（0.5M），3 000 rmp離心1 min后，再加入25 μL無水乙醇3 000 rmp離心30 s，放入-20℃冰箱保存30 min。然后4 ℃ 3800 rmp離心30 min，甩干上清，每孔加入75%乙醇56 μL，充分混勻后，4℃ 3 800 rmp離心25 min，甩干上清，小電風扇干燥30 min。每孔加入7.5 μL高度去離子甲酰胺，瞬離后95 ℃變性

4 min，短暫離心后置于ABI 3500xL DX測序儀測序。本研究采用Chromas軟件判讀測序結果，測序結果與Ensembel數據庫中人基因標準序列進行比對。

1.3 觀察指標 觀察比較兩組性別、年齡、MMSE評分、APOE ε4等位基因頻率（攜帶ε2ε4、ε3ε4或ε4ε4患者例數）和APOE ε4ε4基因型（攜帶ε4ε4患者例數），分析BIN1基因多態性分布情況及與AD關聯性。

1.4 統計學處理 使用SPSS 15.0軟件對所得數據進行統計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗；以P<0.05為差異有統計學意義。基因型的Hardy-Weinberg平衡檢驗采用字2檢驗，P>0.05表示符合遺傳平衡。

2 結果

2.1 兩組臨床特征比較 兩組年齡、性別比較差異均無統計學意義（P>0.05）；AD組MMSE評分低于正常對照組，APOE ε4等位基因頻率和APOE ε4ε4基因型均高于正常對照組，比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.2 BIN1基因多態性分布情況及與AD關聯性分析 BIN1基因多態位點rs7561528在兩組中的基因頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡，見表3；兩組在BIN1基因多態位點rs7561528的基因型頻率（GG、AG、AA）、等位基因頻率比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。見表4。

3 討論

通過既往研究，筆者對SAD易感基因體系的理解發生了明顯的變化，現在普遍認為多個易感基因遺傳變異在SAD的發病機制中共同發揮重要作用。BIN1基因是通過GWAS研究發現與LOAD風險相關性較強的基因。BIN1基因位于人類染色體2q14，包含20個外顯子，可選擇性剪切生成多個亞型，亞型1-7僅在大腦中表達[10]。BIN1蛋白參與多種細胞功能的調節，包括細胞內轉運、細胞的內吞作用、細胞膜形態調節及胞膜循環、細胞骨架調節、細胞周期進展以及凋亡等，其性質改變與多種疾病相關[11-12]。同時有研究證明，BIN1蛋白表達在轉基因AD動物模型以及AD患者腦內有所增加[13-14]。BIN1蛋白可能通過與微管相關蛋白TAU作用，從而增加LOAD的發病風險[15-17]，有研究提出BIN1蛋白主要是通過SH3結構域和TAU蛋白脯氨酸富集結構域相互作用[18]。

BIN1基因首先是Lambert等[8]應用大規模LOAD患者進行的GWAS研究發現其兩個多態位點（rs7561528和rs744373）可能提高LOAD的發病風險。此后，多項獨立的大規模GWAS研究驗證了這一結果的可靠性[6，8]。在中國北方漢族人群研究中，一項AD患者對照研究驗證BIN1基因多態位點rs7561528與AD發病具有關聯性[19]，然而在另一項研究中發現在BIN1基因上其他幾個多態位點在LOAD的進展中發揮作用，但最重要rs7561528結果卻為陰性[20]。這說明來自不同地區的同一群體同樣存在一些差異。本研究結果顯示，兩組rs7561528位點基因型頻率GG、AG、AA和等位基因頻率比較，差異均無統計學意義（P>0.05），提示在中國福建東南部地區AD患者與正常對照人群在BIN1基因rs7561528多態位點基因型頻率和等位基因頻率比較結果無明顯差異，未能證實BIN1基因與中國福建東南地區AD患者存在明顯的關聯性，本研究是首次在福建地區開展類似研究。同時研究結果顯示，AD組MMSE評分低于正常對照組，APOE ε4等位基因頻率和APOE ε4ε4基因型均高于正常對照組，比較差異均有統計學意義（P<0.05），這一結果與既往文獻[9，21]報道一致，進一步證實APOE ε4等位基因與AD發病相關。

綜上所述，BIN1基因多態位點rs7561528可能與中國福建東南部地區AD患者無明顯關聯性，且本研究采用傳統的Sanger測序進行基因多態性分析，判讀分析簡便，結果可靠準確。但研究同時存在一些不足，首先未能對BIN1基因其他多態變異位點進行分析，如rs744373等；其次本研究樣本量相對較小，導致統計時可能存在相對較大的誤差導致研究結果與既往研究不一致，因此更大人群規模的重復研究還是很有必要的。

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（收稿日期：2018-08-07） （本文編輯：董悅）