骨髓基質干細胞在治療脊髓損傷中的應用

楊國宏 潘艷明 趙富生

【摘要】 骨髓基質干細胞（BMSCs）具有取材簡單、增殖速度快、抗原性小和培養過程中始終保持多向分化的潛能等特點，已經成為干細胞研究領域的熱點，是最好的組織工程種子細胞之一。近年研究發現這類細胞具有高度分化的潛能，能分化為神經細胞，為脊髓損傷（SCI）的修復提供了一條新的途徑，具有廣闊的臨床應用前景。

【關鍵詞】 骨髓基質干細胞； 脊髓損傷； 多向分化潛能

【Abstract】 Bone marrow stromal cells（BMSCs） has been considered the hot spot in the study of stem cells owing to their characteristic that is easy to be acquired and be cultured in vitro，negligible antigenicity and keeping multi-differention potentiality and so on.Now，it is one of the best seed cells for tissue engineering stem.In recent years，it is found that marrow stromal cell has well-differentiated potential and it can differentiate into nerve cell and then provide a new strategy to the reparation of spinal cord injury，and it will be using comprehensively in clinical application.

【Key words】 Bone marrow stem cells； Spinal cord injury； Multi-differention potentiality

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2018.31.039

脊髓損傷（SCI）是一種嚴重的中樞神經系統疾病，全球每年因各種原因所造成的SCI患者達五十多萬人，目前治療SCI主要是采用藥物和手術以及后期康復治療等手段[1-3]，這些方法在一定程度上緩解了SCI的病情，但治療效果并不理想，患者往往會出現一定程度的功能障礙。因此，SCI的治療是急需解決的醫學問題，近年來隨著干細胞研究的深入，為SCI的治療帶來了希望。由于骨髓基質干細胞（BMSCs）較其他移植細胞具有取材容易、培養方便、可以傳代并且不改變細胞生物學特性和抗原性、以及沒有倫理問題等優點[4-5]，故受到學者的極大關注。本文就BMSCs治療SCI的主要研究進展做一綜述。

1 BMSC的生物學特性及其分離與培養

1.1 BMSC的生物學特性 體外培養的BMSCs在形態學上主要表現為梭形或紡錘形，核質比大，細胞器少，相鄰細胞之間存在縫隙連接。Forostyak等[6]研究表明，BMSCs在培養分化時表現出貼壁性、可移植、可塑性、可自我更新、克隆速度快等生物學特性。Tamir等[7]研究發現，大多數BMSCs處于G0/G1期，表明該細胞具有強大的增殖能力。體內條件下，BMSCs可以向多種組織遷移并分化為相應的局部細胞，Ferraru將標記的BMSCs經血管注入實驗動物體內，結果發現在受損的肌組織內出現了有被植入BMSCs標記基因的肌細胞，表明植入的BMSCs遷移到受損的肌組織并分化為肌細胞[8]；Brazerlton等[9]觀察到植入的BMSCs在小鼠中樞神經系統內分轉化為神經細胞，在體外，使用不同的誘導劑，可使BMSCs分化為相應的組織細胞；文獻[10]采用體外誘導的方式使BMSCs分化為神經細胞。BMSCs通過分泌白細胞介素12（IL-12）來誘導產生粒細胞集落刺激因子（G-CSF）和粒-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF），改善損傷處的細胞生存環境[11]。BMSCs具有低免疫原性，使其逃避NK細胞和細胞毒性T細胞的殺傷作用[12]。研究表明，BMSCs對機體的免疫功能具有調節作用，可抑制B淋巴細胞、T淋巴細胞和抗原呈遞細胞等多種免疫細胞的活性[13-14]。

1.2 BMSCs的分離方法 常用的分離方法如下，（1）密度梯度離心法：根據BMSCs與其他細胞的密度不同，將骨髓過濾去除骨屑，加分離液后離心，吸取位于界面的BMSCs后進行培養[15]。（2）貼壁篩選法：根據BMSC具有較強的貼壁能力，把全骨髓置于培養基中，經過一段時間的培養，非BMSCs會因沒有貼壁的功能而隨著不斷地換液被清除掉，最后剩下貼壁的BMSCs[16]，該方法具有簡便實用、對細胞活性影響小等優點。將密度梯度離心法與貼壁篩選法進行比較，發現貼壁篩選法獲得的BMSCs貼壁速度快，細胞數量明顯多于密度梯度離心法[17]。（3）流式細胞儀法：根據BMSCs體積小、顆粒少的特點對其加以分離，此法分離BMSCs純度高，但細胞數目少且活性降低[18]。（4）免疫磁性法：利用包有抗體的磁珠與BMSCs表面抗原特異結合的原理，采用一定強度的磁場或流式細胞儀來分離細胞[19]。貼壁篩選法和密度梯度離心法是目前分離BMSCs最常采用的方法。

2 BMSCs的移植

2.1 移植時間的選擇 BMSCs治療SCI的最佳移植時間，目前尚無定論，有學者觀察不同時間窗BMSCs移植在SCI大鼠內存活和遷移的影響，發現SCI后第3天是最佳的移植時間[20]。文獻[21]報道顯示SCI后進行BMSCs移植的最佳時間是在損傷后7～14 d內。Ritfeld等[22]的研究表明BMSCs在SCI后7 d內植入對神經的保護作用最理想。鑒于SCI后的幾天內脊髓損傷處可出現廣泛的壞死和嚴重的炎癥反應，而在損傷12～14 d后，損傷處可出現囊腫和膠質瘢痕，因此筆者認同Lu等[23]的BMSCs移植的最佳時間應為SCI后第9天前后的觀點。

2.2 移植方式 BMSCs移植方式主要包括直接注射、經腦脊液注射、靜脈輸入、誘導分化后移植等方法。直接注射是指在損傷部位直接注射BMSCs懸浮液；后幾種方法是將細胞懸浮液分別經腰穿或靜脈注入腦脊液或靜脈血中，通過細胞的遷移作用到達脊髓損傷部位。直接注射保證了干細胞能移植到損傷部位，但需要承受麻醉、腦脊液外漏以及受損神經組織發生炎癥的風險，而且還需要多次注射，這使得其臨床應用受到很大限制。靜脈注射是一個簡單的辦法，但細胞還未到達脊髓損傷部位就可能已經定植在其他器官，更重要的是脊髓損傷大多伴有其他器官損傷，細胞移植后可能遷移到所有受損區域，這使得干細胞并沒有全部到達脊髓損傷區域。經腦脊液注射的方法不需麻醉，操作簡便，只需在椎間隙進針，不會傷到脊髓。研究者經腰椎間隙將BMSCs注入大鼠蛛網膜下腔，觀察發現BMSCs會聚集在脊髓損傷區的表面和血管周圍，說明BMSCs能夠通過腦脊液循環到達脊髓損傷區域，進而發揮脊髓再生的作用[23]。腺病毒載體及轉基因細胞移植因涉及倫理問題和相關審批制度，故其研究目前多局限于動物模型[24]。因此，經腦脊液注射法被認為是目前最好的移植方法。

3 BMSCs治療SCI的機制

主要的機制如下，（1）研究顯示，BMSCs在某些條件下可誘導分化為膠質細胞和神經元樣細胞，填充損傷部位組織，在局部形成神經回路，并能鏈接到植入體神經網絡中，使損傷部位的神經傳導得以恢復[25-26]；（2）BMSCs可起到一個細胞橋的作用填充損傷區，提供化學或機械的引導，引導再生神經通過損傷區，完成功能的重建[27]。（3）BMSCs可產生多種神經營養因子，如神經生長因子、腦源性神經營養因子等，這些因子表達上調可促進局部微血管和神經再生，起到損傷修復作用[28]。（4）有學者研究發現BMSCs通過激活多肽（PACAP）基因，進而降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等促炎性因子的表達以及增加抗炎性因子的表達來降低損傷部位的炎癥反應，促進脊髓橫斷大鼠損傷局部的組織修復[29]。楊新明等[30]認為BMSCs通過分泌多種抗氧化能力的因子，來抑制氧化應激反應；也可能是通過生成新的血管來改善損傷部位的缺血狀況，進而促進神經組織的重建。Hu等[31]研究表明BMSCs移植后可通過分泌生物活性物質白細胞介素-7（IL-7）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）使SCI部位血管再生。

4 BMSCs移植治療SCI的實驗研究

BMSCs移植治療SCI的動物實驗研究有很多。總體來說，治療效果比較理想，現介紹幾例。研究者將導入膠質細胞源性神經營養因子基因的BMSCs進行移植，移植細胞持續表達高水平膠質細胞源性神經營養因子蛋白，可穩定發揮神經營養作用，促進脊髓損傷的修復[32]。Ding等[33]報道電針刺激療法與過表達TrkC的BMSCs體內移植結合起來，結果局部層粘連蛋白和生長相關蛋白（GAP-43）明顯上調，而膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和硫酸軟骨素蛋白多糖（CSPGs）則出現了明顯下調，示蹤發現皮質脊髓束5-HT陽性神經纖維長入并通過損傷部位。Cantinieaux等[34]發現，使用BMSCs的條件性培養基（BMSC-CM）也可以促進SCI后的神經修復，改善動物的運動功能；而Ritfeld等[35]的研究表明，BMSCs移植后可通過促進血管新生及軸突生長來改善大鼠的感覺和運動功能。這些動物研究為BMSCs應用到SCI的臨床治療提供了部分實驗依據。

5 BMSCs移植治療SCI的臨床應用

由于目前對于干細胞的臨床應用存在比較嚴格的審核制度，故BMSCs治療SCI的臨床報道比較少。Yazdani等[36]在臨床實驗中發現，BMSCs移植治療脊髓損傷安全并且療效明顯。Pal等[37]將體外培養的患者自體BMSCs，注射到30例SCI患者脊髓損傷處，有3例患者隨訪3年，20例患者隨訪1～2年。結果發現這些患者均有一定程度的功能恢復且沒有明顯的副反應。Syková等[38]于2006年將患者自體的BMSCs種植在一種在體內可以降解的移植支架上后，再移植到20例SCI患者體內（7例急性SCI患者，13例慢性SCI患者）。3個月內，5例急性SCI患者和1例慢性SCI患者運動和感覺功能得以恢復，2年內無一例患者出現任何并發癥。Moviglia等[39]于2006年報道了將BMSCs轉分化為神經干細胞后注射治療2例慢性SCI患者的臨床結果，治療3個月后，2例患者的運動和感覺功能明顯恢復，患者均未出現不良反應。在2008年，Saito等[40]報道了1例人BMSCs應用于SCI的臨床試驗，患者從高空墜落，C5椎體骨折合并SCI，術后移植自體BMSCs，半年后，患者運動和感覺功能均有明顯改善，而且沒有免疫反應和副反應。趙廷寶等[41]于2006年報道了8例SCI患者接受自體BMSCs和異體髓鞘細胞聯合移植，接受移植的患者術后均無不良反應，其中1例于術后30 d開始出現下肢感覺恢復，其余患者與移植前無改善。還有研究報道，對于慢性期BMSCs移植雖然沒有并發癥發生，但效果并不明顯；對于亞急性期和慢性期SCI的BMSCs自體移植治療尚需要更多的亞臨床實驗證實[42]。

6 問題與展望

由于BMSCs具有多向分化能力且易于分離培養及免疫原性低等優點，使其在臨床應用方面前景廣闊。學者已經在BMSCs移植治療SCI動物實驗上取得了較大的進展，但臨床應用才剛剛起步，相信在廣大學者的不懈努力下，BMSCs有可能在SCI治療這一世界醫學難題中發揮重要作用，為廣大SCI患者帶來福音。

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（收稿日期：2018-05-15） （本文編輯：董悅）