Roche定量試劑和國產PCR試劑檢測HBV—DNA的比較分析

周美英+高國生+胡愛榮

[摘要] 目的 探討Roche定量試劑和國產PCR試劑檢測慢性HBV感染者血清HBV-DNA的差異。 方法 收集慢性HBV感染患者366例，包括慢性乙型肝炎患者247例，乙肝肝硬化失代償患者72例，乙肝相關性肝癌患者28例，乙型慢加急性肝衰竭患者19例；采用Roche定量試劑（試劑A）和和國產PCR試劑（試劑B）檢測患者血清HBV-DNA，比較檢測結果的差異、相關性及影響因素。 結果 試劑B 124例（33.88%）低于檢測下限而試劑A高于檢測下限（包括24例超過1.00×103 IU/mL，考慮試劑B為假陰性）；試劑A的陽性率（70.49%）顯著高于試劑B（36.61%）（P<0.01）。試劑A的HBV-DNA檢測均值高于試劑B（P<0.05），HBeAg滴度低者、終末期患者更容易出現(xiàn)COBAS系統(tǒng)的血清HBV-DNA檢測值高于國產試劑的情況。Spearman相關分析顯示，兩種試劑在1.00×103 IU/mL

[關鍵詞] 乙型肝炎病毒；COBAS Taqman系統(tǒng)；熒光定量PCR

[中圖分類號] R446.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）34-0114-04

Comparative analysis of Roche quantitative reagent and domestic PCR reagent for detection of HBV-DNA

ZHOU Meiying1 GAO Guosheng2 HU Airong3

1.Center Laboratory，Zhejiang Taizhou Hospital，Taizhou 317000，China；2.Department of Clinical Laboratory，Ningbo City Second Hospital，Ningbo 315010，China；3.Department of Liver Diseases，Ningbo City Second Hospital，Ningbo 315010，China

[Abstract] Objective To investigate the difference in detecting serum HBV-DNA of chronic HBV infection patients between Roche quantitative reagent and domestic PCR reagent. Methods 366 patients with chronic HBV infection were collected， including 247 patients with chronic hepatitis B， 72 patients with decompensated liver cirrhosis， 28 patients with hepatitis B-related hepatocellular carcinoma and 19 patients with acute-on-chronic liver failure. Roche quantitative reagent（reagent A）and domestic PCR reagent（reagent B）were used to detect the serum HBV-DNA. And the difference of the detection results， the correlation and influencing factors between the two reagents were compared. Results There were 124 cases（33.88%） which were below the detection limit detected by reagent B and above the detection limit detected by reagent A， including 24 cases more than 1.00×103 IU/mL， considering reagent B as false negative. The positive rate of reagent A（70.49%） was significantly higher than that of reagent B（36.61%）（P<0.01）. The detection mean values of HBV-DNA by reagent A was higher than those of reagent B（P<0.05）. The patients with lower HBeAg titers， end-stage were more prone to appear the situation that the serum HBV-DNA of the COBAS system was higher than that of the domestic reagent. Spearman correlation analysis showed that the correlation was better when two reagents were in the 1.00×103 IU/mL

[Key words] Hepatitis B virus； COBAS Taqman system； Fluorescence quantitative PCR

我國是乙型肝炎病毒（HBV）感染的高流行地區(qū)，其中1～59歲普通人群乙肝表面抗原的攜帶率約為7.18%[1]。HBV-DNA的檢測對于HBV相關疾病的診斷與治療均十分重要[2]，目前國內醫(yī)療機構多采用國產PCR試劑，而國際“金標準”是Roche公司的COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan實時熒光PCR定量檢測試劑盒，這兩種試劑在敏感性、準確性、重復性、線性范圍等方面均存在差異[3-4]。在實際臨床工作中，對于如何評價、選擇和使用HBV-DNA檢測仍存在一些理解不到位的地方，由此可能導致誤診、誤治。本文從多個角度對國產PCR試劑和Roche定量試劑檢測HBV-DNA作比較分析，為臨床合理、正確地應用相應試劑檢測HBV-DNA提供實驗依據。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2013年12月～2015年10月在本院肝病中心就診的慢性HBV感染患者366例，包括247例慢性乙型肝炎（CHB）患者，72例乙肝肝硬化失代償患者，28例乙肝相關性肝癌患者，19例乙型慢加急性肝衰竭患者，后三者歸為終末期肝病。其中男261例，女105例；年齡5～81歲，平均（43.94±12.96）歲，所有患者診斷標準依據《慢性乙型肝炎防治指南》（2015版）[5]。HBV感染患者均為單一HBV感染，排除其他肝炎病毒或原因引起的肝病。

1.2 方法

所有患者標本同時用兩種試劑（或方法）檢測HBV-DNA，試劑A采用Roche COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan 48系統(tǒng)的配套試劑；試劑B由國內某公司生產的熒光定量PCR試劑（為避免商業(yè)利益糾紛，以試劑B替代其名稱），檢測儀器采用美國ABI 7500型熒光定量PCR儀。根據檢測結果分為兩組，A組為試劑A的檢測值高于試劑B，B組為B的檢測值高于試劑A。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行處理。正態(tài)分布計量資料以均數±標準差表示，兩組比較采用t檢驗；偏態(tài)分布計量資料采用M（Q25，Q75）表示，兩組比較采用Mann-Whitney U非參數檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗；采用Spearman相關分析兩種試劑（或方法）檢測HBV-DNA的相關性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1 兩種試劑的基本特征比較

試劑A的HBV-DNA檢測值范圍20.9～>1.70×108 IU/mL，試劑B的HBV-DNA檢測值范圍617.00～5.62×108 IU/mL。其中108例（29.51%）A、B兩種試劑均低于檢測下限，124例（33.88%）試劑B低于檢測下限而試劑A高于檢測下限（包括24例超過1.00×103 IU/mL，考慮試劑B為假陰性），134例（36.61%）檢測結果均高于兩種方法的檢測下限。試劑A的陽性率為70.49%，試劑B的陽性率為36.61%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2=84.45，P<0.01）。

2.2兩種試劑HBV-DNA檢測值的比較及影響因素

全部患者試劑A的HBV-DNA檢測均值為（2.85±2.57）Log10 IU/mL，試劑B的HBV-DNA檢測均值為（1.89±2.67）Log10 IU/mL，試劑A的檢測均值顯著高于試劑B（t=12.47，P<0.01）。試劑A的檢測值高于試劑B 204例（A組），試劑B的檢測值高于試劑A 46例（B組，其中4例試劑A的檢測值報告形式>1.70×108 IU/mL故予以剔除），其余112例試劑A、B的檢測值相同（包括108例A、B兩種試劑均低于檢測下限、4例檢測值完全一致）；組別A和B的HBeAg滴度、終末期患者比例差異均有統(tǒng)計學意義（U=1305.00、χ2=6.42，P<0.05），而性別比例、年齡和ALT水平差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.31，t=1.07，U=4350.00，P>0.05），見表1。

2.3兩種試劑的相關性分析

以試劑A為標準，Spearman相關分析顯示，1.00×103 IU/mL0.70），見表2。

3討論

傳統(tǒng)的HBV血清標志物如HBsAg、HBeAg等是病毒感染和復制的間接指標，但其受病毒變異、患者免疫狀態(tài)等多種因素的影響，而血清HBV-DNA定量則更為直接，可以反映患者體內病毒復制活動情況。血清HBV-DNA的檢測一般基于熒光定量聚合酶鏈反應或多聚酶鏈反應（PCR），該技術自上世紀80年代逐步發(fā)展起來，具有敏感、特異、快速、簡便、重復性好、易于自動化、定量范圍寬等優(yōu)點。國內有多個品牌的PCR試劑盒，但諸如核酸的提取、標本的狀態(tài)、退火溫度、引物的設計等均沒有標準化[6]，故檢測結果之間存在差異。COBAS AmpliPrep-COBAS TaqMan實時熒光PCR定量檢測試劑盒由美國食品與藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準，由于增加進入檢測體系的樣品容積（達到650 μL，遠高于國產試劑盒的50～100 μL）可以顯著提高敏感度、采用全自動的核酸提取系統(tǒng)并通過磁珠吸附法純化可以有效提取核酸、設置了內參故可以有效彌補標本間核酸提取效率的差異及反應體系中可能存在的抑制物質的影響、采取多對覆蓋高變區(qū)的引物探針可以避免由于病毒變異導致的假陰性，故一般認為其靈敏度、準確度、重復性等較國產試劑更好[3-4，7-8]。

本研究結果表明，COBAS系統(tǒng)有更靈敏的檢測下限，血清HBV-DNA的最小準確檢測值可達20.93 IU/mL，但其檢測上限（1.70×108 IU/mL）稍遜于國產試劑（5.62×108 IU/mL），與既往的報道基本一致[9-10]。而且共366例患者中有124例（33.88%）出現(xiàn)兩種方法的檢測結果明顯不一致，全都為國產試劑低于檢測下限而COBAS系統(tǒng)高于檢測下限。邵國輝等[11]分析了112份經國產試劑檢測結果低于檢測下限的擬停藥乙肝患者血清標本，經COBAS系統(tǒng)再次檢測有72例（64.29%）高于高靈敏度HBV-DNA檢測下限（20 IU/mL），與本研究的結論基本相似（甚至有更高的比例）。需要指出的是，本研究中還有24例患者超過1.00×103 IU/mL，而這些患者可能為國產試劑假陰性的表現(xiàn)。陳占國等[12]認為由于近年來抗病毒藥物的廣泛使用，由于病毒變異導致試劑對突變的HBV存在檢測盲區(qū)或效率低下，出現(xiàn)假陰性的概率逐年增加，這在一定程度上解釋了本文的分析結果。因此，COBAS系統(tǒng)檢測HBV-DNA的陽性率也顯著高于國產試劑，張玥等[13]也有類似的報道。故在臨床實際工作中，對于那些慢性HBV感染患者多次國產試劑檢測血清HBV-DNA<1.00×103 IU/mL而無明確其他肝損原因、接受抗病毒治療后血清HBV-DNA長期<1.00×103 IU/mL，但血清ALT、AST持續(xù)異常者均有必要采用COBAS系統(tǒng)予以復查確認病毒的真正復制狀態(tài)并排除由于試劑原因導致的假陰性。

臨床上，HBV-DNA檢測結果的假陰性會延誤部分患者的抗HBV治療的時機。對失代償期肝硬化患者抗病毒治療，我國指南提出只要HBV-DNA可檢測到，就可應用核苷（酸）類似物進行治療，與2009年版AASLD指南的觀點一致[1，14]。另外《慢性乙型肝炎抗病毒治療專家共識》指出[15]，對年齡超過40歲或有肝硬化、肝細胞癌家族史的慢乙肝患者，也有同樣的建議。但因應用國產試劑檢測下限HBV-DNA<1.00×103 IU/mL，將導致一部分患者不能得到及時治療。本研究證實了這一點，以1.00×103 IU/mL作為HBV-DNA檢測下限，將有27.32%（100/366）的患者不能得到及時的抗病毒治療，這將增加該部分患者病情進展的風險。

進一步的分析發(fā)現(xiàn)，COBAS系統(tǒng)的血清HBV-DNA檢測均值顯著高于國產試劑，通過配對比較發(fā)現(xiàn)366例患者中，204例試劑A的檢測值高于試劑B，只有50例試劑B的檢測值高于試劑A，與部分學者[9，16]的觀點基本一致，表明COBAS系統(tǒng)的平均擴增效率優(yōu)于國產試劑，且本研究還發(fā)現(xiàn)HBeAg滴度低者、終末期肝病患者更容易出現(xiàn)COBAS系統(tǒng)的血清HBV-DNA檢測值高于國產試劑的情況，其中緣由可能與此類患者體內乙肝病毒變異率高有關，故此時宜選用COBAS系統(tǒng)檢測血清HBV-DNA方可更準確地反應機體內病毒復制情況。

兩種試劑的相關性分析表明，在HBV-DNA<1.00×103 IU/mL時相關性較差，與倪俊明等[17-19]研究結果一致，這可能與部分患者在低病毒載量時國產試劑難以檢測出病毒復制水平有關；而在高水平復制狀態(tài)時（>1.00×107 IU/mL）由于COBAS系統(tǒng)的檢測上限限制，兩種試劑的相關性也較差。但在1.00×103 IU/mL

總之，國產PCR試劑可以用于抗病毒治療的隨訪、監(jiān)測，基本滿足臨床的需求，但其靈敏性、準確性相較COBAS系統(tǒng)仍有差距，特別是針對那些懷疑有低病毒復制狀態(tài)或病毒變異導致國產PCR試劑假陰性的患者，更有必要用COBAS系統(tǒng)予以復核。同時，由于本文病例的選擇并非完全隨機，故確切結論仍需大樣本、多中心的數據予以驗證。

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（收稿日期：2017-08-11）