基于多波長HPLC—DAD比較梔子不同部位化學成分差異

肖日傳+羅光明+董麗華+朱玉野+朱繼孝+張風波+伍珊娜

[摘要] 采用多波長HPLC-DAD，同時測定梔子不同部位去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ和竹節參皂苷Ⅳa 7種化合物的含量，比較各成分在梔子不同部位的分布。結果表明梔子中各成分在各部位分布不同，且含量存在較大差異，其中梔子苷主要分布在果實和葉中，竹節參皂苷IVa主要分布于根和莖中，西紅花苷類成分主要存在于果實中，綠原酸以葉和莖含量較高，羥異梔子苷在葉和根中含量較高，去乙酰車葉草酸甲酯在根和莖中含量較高。通過分析梔子不同部位化學成分含量差異，為梔子資源綜合開發利用和質量評價提供依據。

[關鍵詞] 多波長高效液相色譜； 梔子； 不同部位； 化學成分

[Abstract] Seven compounds（deacetylasperulasidic acid methyl ester， gardenoside， chlorogenic acid， geniposide， crocin-Ⅰ， crocin-Ⅱ， chikusetsu saponin Ⅳa）were determined simultaneously by multiple wavelength HPLC with diode array detector（DAD） in different parts of Gardenia jasminoides. The results showed that these components in different parts of G. jasminoides had a different distribution， and there was a large difference in content of each component. Geniposide was mainly distributed in fruits and leaves； chikusetsu saponin Ⅳa was mainly distributed in roots and stems； crocus glycosides existed mainly in fruits； chlorogenic acid had a higher distribution in leaves and stems； gardenoside had a higher distribution in leaves and roots， while ceacetylasperulasidic acid methyl ester had a higher distribution in roots and stems. Based on the analysis of the chemical composition and content difference in different parts of G. jasminoides， the basis for the comprehensive utilization and quality evaluation of resources of G. jasminoides was provided.

[Key words] multiple wavelength HPLC； Gardenia jasminoides； different parts； chemical composition

梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果實。主產于江西、湖南、湖北等地，性苦寒，有瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒之功效[1]，外用消腫止痛，梔子的主要活性成分為環烯醚萜類、有機酸類、西紅花苷類等[2]，現代藥理研究表明梔子果實具有護肝、利膽、抗炎、抗菌、解熱、鎮痛和降血脂等作用。國內外對梔子藥材的研究主要集中在傳統用藥部位果實上，而其他部位的研究則鮮有報道，據《湖南省中藥材標準》[3]和《浙江省中藥飲片炮制規范》[4]記載，梔子除果實可入藥外，其根部也可入藥，在少數民間應用廣泛，主要含有齊墩果酸醋酸酯、齊墩果酸和竹節參皂苷Ⅳa等化學成分[5-6]，可用于治療黃疸型肝炎；鄭麗花等[7]對狹葉梔子的莖部位進行了化學成分的分離研究，從中鑒定出11種化合物，而王雪芬等[8]同時從梔子的根和莖中分離得到了相同的3種成分；對于梔子葉的研究，李運等[9]從該部位分離鑒定出8種化合物，表明梔子的其他部位均有一定的利用價值。

目前，有關梔子藥材含量測定的報道很多，2015年版《中國藥典》僅以梔子苷作為唯一檢測的指標性成分，相關文獻在此基礎上亦測定去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、京尼平龍膽二糖苷等環烯醚萜類成分[1]，綠原酸成分和西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ等西紅花苷類成分[2]，以便更全面地評價和反映梔子藥材的內在品質；而梔子其他部位的含量測定研究則報道較少，李紅等[10]以梔子根中齊墩果酸醋酸酯水解后的齊墩果酸為測定指標探索梔子根的最佳采收時間和生長期，相關學者則認為由于梔子根中含有部分游離型齊墩果酸，故水解后的齊墩果酸不能準確完全地反映藥材質量，而竹節參皂苷Ⅳa在鎮痛、抗炎、抗腫瘤等方面表現出一定的生理活性，作為質控標準更為合理[11]；此外，梔子莖、葉部位的含量測定仍屬空白。因此綜合梔子果實的主要化學成分和其他部位的含量測定研究，本實驗采用多波長高效液相色譜法，首次建立同時測定梔子果實、根、莖、葉各部位中去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節參皂苷Ⅳa 7種化學成分的含量測定方法，系統地比較梔子不同部位化學成分含量差異，分析不同部位各類成分的分布特征，為梔子不同部位的質量評控和梔子藥材資源的綜合開發利用提供理論支持。

1 材料

Waters e2695高效液相色譜儀，四元泵及自動進樣系統，2998PDA檢測器，美國Waters公司；DFY-400搖擺式中藥粉碎機，浙江溫嶺市林大機械有限公司；KQ3200DB型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；GZX-9070 MBE數顯鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司醫療設備廠；色譜甲醇，美國ACS公司；色譜乙腈，美國ACS公司；Milli-Q超純水（18.2 Ω），江西中醫藥大學中藥資源與民族藥中心；其余試劑為分析純。endprint

去乙酰車葉草酸甲酯（批號111786-201603）、梔子苷（批號110749-201614）、綠原酸（批號110753-201514）、西紅花苷Ⅰ（批號111588-201602）、西紅花苷Ⅱ（批號111589-201604）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；羥異梔子苷（批號PJM0324RB16）購自上海源葉生物科技有限公司；竹節參皂苷Ⅳa（批號MUST-17030201）購自成都曼斯特生物科技有限公司。梔子藥材于2016年10月采自江西九江湖口縣順昌中藥材種植基地，原植物經江西中醫藥大學中藥資源學科組葛菲教授鑒定為茜草科植物梔子G. jasminoides。取樣時采挖整株植物，洗凈泥土，將其分為果實、根、莖、葉4部分，自然干燥，分別粉碎過4目篩，置干燥器中備用。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

Durashell C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫：0～18 min，5%～15% A；18～25 min，15%～23% A；25～40 min，23%～35% A；40～50 min，35%～60% A；50～60 min，60%～95% A。體積流量為1 mL·min-1；柱溫30 ℃；檢測波長203，238，330，440 nm；進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

分別精密吸取各對照品適量，加70%甲醇溶解分別制成含去乙酰車葉草酸甲酯0.015 6 g·L-1、羥異梔子苷0.295 0 g·L-1、梔子苷1.564 0 g·L-1、綠原酸0.139 2 g·L-1、西紅花苷 Ⅰ 0.831 0 g·L-1、西紅花苷Ⅱ 0.122 0 g·L-1、竹節參皂苷Ⅳa 0.371 0 g·L-1的混合對照品儲備液，于4 ℃冰箱保存備用，臨用前經0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.3 供試品溶液的制備

取梔子果實、根、莖、葉粉末各0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，稱定質量，超聲提取45 min，放冷后稱重，用70%甲醇補足失重，搖勻濾過，取續濾液，用0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 精密吸取2.2項對照品儲備液1，2，4，6，8，10 μL，分別注入液相色譜儀中，按2.1項色譜條件測定。以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行回歸分析，回歸方程見表1。

2.4.2 精密度試驗 精密吸取2.2項混合對照品溶液10 μL，連續進樣6次，計算7種成分峰面積的RSD，考察儀器精密度，結果去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節參皂苷Ⅳa的RSD分別為0.22%，0.37%，0.10%，0.074%，0.16%，0.24%，0.092%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 按2.3項方法平行制備6份供試品溶液，各取10 μL進樣，測定7種成分含量，計算峰面積的RSD，考察方法重復性，結果去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節參皂苷Ⅳa的RSD分別為1.8%，2.2%，0.64%，0.71%，0.68%，0.87%，1.0%，表明方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL，分別于0，2，4，8，16，24 h進樣分析，記錄7種成分峰面積，計算峰面積的RSD，考察供試品溶液穩定性，結果去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節參皂苷Ⅳa的RSD分別為0.72%，0.88%，1.2%，1.3%，0.65%，0.83%，1.6%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.5 加樣回收率試驗 取已知含量的藥材粉末6份，每份約0.25 g，分別精密加入對照品溶液適量，按2.3項方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定，分別計算各成分加樣回收率及其RSD。結果去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節參皂苷Ⅳa的加樣回收率分別為101.3%，96.80%，97.54%，99.06%，103.6%，101.7%，98.96%，RSD分別為2.6%，2.8%，2.1%，1.9%，1.8%，2.3%，2.0%，表明該方法的準確度良好。

2.5 不同部位各類成分含量比較

取梔子果實、根、莖、葉各部位的干燥粉末，按供試品制備方法進樣操作，以外標法計算同一批次梔子藥材不同部位中去乙酰車葉草酸甲酯、羥異梔子苷、梔子苷、綠原酸、西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ 和竹節參皂苷Ⅳa的色譜圖見圖1～4。含量結果見表2。

3 討論與分析

3.1 梔子不同部位化學成分比較

實驗藥材采自江西九江湖口縣梔子GAP種植基地，均為隨機取樣，具有代表性。從本實驗結果可以看出，梔子不同部位各成分種類和含量差異較大，西紅花苷類成分只在果實中存在，根、莖、葉中均不含；果實和葉中未檢測到竹節參皂苷Ⅳa，而根和莖中含有竹節參皂苷Ⅳa且根部的含量大于莖；根和莖中未檢測到梔子苷，而果實和葉中含有梔子苷且果實中含量大于葉；有機酸類成分在各部位均有分布，含量由高到低依次為葉、莖、根、果實；去乙酰車葉草酸甲酯在根和莖中的含量較高，葉次之，果實中最低；羥異梔子苷在葉和根中的含量較高，莖次之， 果實中較低；測定結果表明，梔子不同部位各成分含量差異較大。梔子苷作為果實的指標性成分，在果實中的含量明顯高于其他部位。2015年版《中國藥典》記載梔子果實為傳統的入藥部位，而根部也作 藥用，為畬族常用藥材，畬醫稱其為“山里黃根”，在浙江、福建、湖南等地的民間主要用于治療黃疸型肝炎、肝炎后肝纖維化、風火牙痛等病癥[12-13]，其臨床應用由來已久，1964年，廈門市中醫院康良石等[14]名老中醫采用水邊黃梔子根治愈傳染性肝炎病例30例，1975年，廣西中醫學院伍紹岐[15]以板藍根和梔子根湯合用治愈急性黃疸性肝炎病例53例，效果良好，此外，臨床上已有松梔丸、復方梔子根顆粒、梔子根湯等以梔子根為君藥配伍使用的中藥復方。竹節參皂苷Ⅳa作為梔子根中主要的化學成分之一，表現出一定的抗炎、鎮痛、抗腫瘤作用，陳偉東等[16]endprint

人以金黃色葡萄球菌為試驗菌株，研究梔子根的抗菌生物活性與竹節參皂苷Ⅳa含量的相關性，結果表明起抗菌作用的可能不僅僅為該成分，是否為多組分協同作用，仍有待進一步的深入探討。

3.2 色譜條件的選擇

本實驗基于梔子果實的傳統含量測定方法梯度洗脫條件并對其進行了改進，梔子果實在35%乙腈梯度之前所有化學成分均已出峰，而通過前期摸索，發現梔子根、莖、葉在35%乙腈梯度以后仍有少量成分，故加長時間，讓各成分達到有效分離。考察了不同濃度的磷酸溶液，發現0.2%磷酸水溶液能獲得較好的峰形。對于檢測波長的選擇，由于梔子果實中含有環烯醚萜類、有機酸類、西紅花苷類等多類成分，梔子根中含有竹節參皂苷Ⅳa等三萜皂苷類成分，單一波長難以全面反映梔子化學成分組成的全貌，故本實驗采用DAD檢測器對梔子樣品進行全波長掃描（190～800 nm），對各波長下的色譜圖進行分析比較，結果發現環烯醚萜類、有機酸類、西紅花苷類的最大吸收波長分別為238，330，440 nm，而三萜皂苷類成分竹節參皂苷Ⅳa為末端吸收，最大吸收波長為203 nm，所以本實驗采用203，238，330，440 nm多個波長最大可能地獲取色譜組分信息，以分析比較梔子各部位化學成分的差異。

3.3 提取條件的優化

對影響提取效果的樣品提取溶劑、溶劑濃度、提取時間和提取方法4個因素進行了考察。采用了50%甲醇、70%甲醇、純甲醇和50%乙醇、70%乙醇、純乙醇提取樣品，通過觀察色譜圖峰形、比較總峰面積，發現以70%甲醇提取色譜峰較多且吸收大，確定70%甲醇為提取溶劑。采用了回流提取和超聲提取兩種提取方法進行考察，結果表明超聲提取法較簡便，效率高，回流提取較繁瑣。綜合考慮，選擇超聲提取作為樣品的提取方法。提取時間采用了30，45，60，75 min，結果表明45 min為最佳提取時間，能最有效地提取各成分。

本實驗首次采用多波長高效液相色譜法對梔子不同部位各成分進行了含量測定研究，基于中藥材“一體多用”原則，為梔子非傳統藥用部位或新藥用部位的開發利用提供實驗依據，為梔子各部位質量控制評價奠定物質基礎，對梔子新藥新產品的創制研發具有一定的現實意義。

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[責任編輯 丁廣治]endprint