鋅指樣轉錄因子4與動脈粥樣硬化研究進展

羅彩云 丁家望 鄭霞霞 周 天 張再強

(三峽大學第一臨床醫學院心內科，湖北 宜昌 443003)

動脈粥樣硬化(AS)是引起心血管事件的病理基礎，其發病機制尚不明確。目前更傾向于認為AS是一種慢性血管炎癥性疾病〔1〕，血管壁在各種內源性及外界刺激下損傷，多種炎癥因子、免疫細胞及相關細胞因子相互作用發揮炎性效應，形成慢性炎癥。近來發現，鋅指樣轉錄因子(KLF)4是參與調控心血管系統的重要轉錄因子〔2〕，能通過不同途徑抑制或激活炎性因子，調控血管內皮細胞活化、巨噬細胞極化、平滑肌細胞(SMC)增殖和遷移，發揮心血管保護作用。本文探討KLF4在AS的作用。

1 KLF4的概述

KLFs家族屬于真核生物中含鋅指結構較保守的轉錄因子家族，是生物體內一類具有重要功能的蛋白質，參與細胞生長、增殖、分化及凋亡等多個生命活動的調控〔2〕。KLF4是KLFs家族中的一員，在機體多種組織及細胞表達，如血管內皮、SMC、巨噬細胞等。KLF4基因定位于9q31，其cDNA編碼全長為1 413 bp，編碼由470個氨基酸組成的蛋白質。KLF4具有3個不同功能的結構域，包括DNA結合結構域、轉錄調節結構域和核定位序列，是其發揮生物學效應的基礎。DNA結合結構域位于羧基末端，主要識別并結合與其具有高度親和力的富含GC的DNA序列〔3〕，這是KLF家族其中一個顯著的特點。KLF4氨基端含有轉錄調節結構域，包括兩個不同位點的轉錄激活結構域和轉錄抑制結構域，表明 KLF4具有激活基因轉錄和抑制基因轉錄雙重效應。由于非DNA結合區域高度變異，KLF4能與不同靶基因結合發揮不同的生物學效應。KLF4在細胞周期或細胞凋亡中發揮作用，主要是通過抑制P53的表達參與調節細胞周期中的G1/S期和G2/M期〔4〕。

2 KLF4與AS炎癥細胞的相互作用

KLF4是AS斑塊浸潤的SMC、內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞等細胞中的重要轉錄因子，在不同細胞中發揮著不同的作用，從基因水平上調控靶基因將為防治AS提高到新水平。

2.1KLF4與SMC表型轉化 血管SMC(VSMCs)的表型轉化是高血壓、AS和血管再狹窄等血管重塑性疾病的主要病理學基礎〔5〕。正常VSMC呈收縮表型，KLF4低表達，但是，當氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)、免疫損傷等AS危險因素存在時，SMC向合成型轉化，KLF4表達水平明顯升高〔6〕，這表明KLF4表達水平的高低與SMC表型有關。Shankman等〔7〕研究發現，條件性敲除SMC KLF4基因可抑制SMC表型轉化及增強斑塊穩定性，免疫沉淀技術檢測到SMC有多個KLF4靶點，而這些靶點可能參與吞噬、凋亡、細胞遷移及炎癥等多個過程，抑制或促進AS發生發展。由此推斷，VSMC表型的轉化受到KLF4信號網絡的調控。

Myocardin是血清反應因子(SRF)的轉錄激活因子，通過調控 CArG-盒依賴性基因，參與SMC分化的關鍵環節〔8〕。Turner等〔9〕研究發現，Myocardin啟動子內的上游阻遏區域(URR)有3個進化保守的KLF4位點，在特定條件下阻遏KLF4與啟動子結合，持續促進Myocardin基因表達。相反，當KLF4過表達顯著降低Myocardin mRNA水平，抑制Myocardin對SMC分化標記基因的激活作用。然而，KLF家族中的KLF5或KLF2并不具備這種功能。這表明，KLF4在調控SMC分化標志基因方面可能具有特異性。還有研究發現，KLF4是一個直接受過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ蛋白調控的下游靶因，PPARγ拮抗劑通過激活Akt蛋白激酶信號及抑制KLF4去泛素化來維持KLF4蛋白的穩定表達，從而影響VSMCs增殖分化〔10〕。

表觀遺傳調控是判定SMC分化狀態的一個重要調節方式，尤其是在SMC分化標志基因啟動子區域組蛋白乙酰化修飾的調控。SMC染色質結構受到多種因素的影響，轉化生長因子(TGF)-β1是一個強效促 VSMC 分化因子，TGF-β1 通過介導p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和smad信號通路促進磷酸化KLF4與P300結合及組蛋白H3乙酰化，從而促進SMC標志基因的轉錄〔11，12〕。而視黃酸活化KLF4與TGF-β1 有著類似的作用方式〔13〕。促SMC增殖刺激因子血小板源性生長因子(PDGF)-BB誘導KLF4去磷酸化和組蛋白去乙酰化酶(HDAC)2去乙酰化，兩者與細胞外信號調節激酶(ELK)1協同作用抑制SMC標志基因的表達〔14〕，這表明，促使組蛋白乙酰化的因素都與誘導KLF4 表達有關，可以推斷，染色質重塑的過程依賴于KLF4。SMC α-actin標志基因組蛋白H4乙酰化，被發現是HDAC2和HDAC5與KLF4直接交互作用產生〔15〕。這一結果進一步說明，KLF4 是通過組蛋白乙酰化修飾抑制SMC分化標志基因。研究KLF4與組蛋白乙酰化之間的關系，從表觀遺傳學角度揭示VSMC表型調節機制及分化的新機制。

MicroRNAs代表控制SMC分化狀態的另一種表觀遺傳機制，通過針對性降解信使RNA發揮轉錄后抑制作用。miR-1與KLF4直接結合調控胚胎干細胞向SMC分化〔16〕。KLF4是TGF-β和骨形態發生蛋白(BMP)4誘導SMC收縮基因表達的先決條件，TGF-β和BMP4通過誘導miRs-143 和miRs-145迅速下調KLF4表達〔17〕。此外，KLF4介導miR-15a阻止細胞周期進程，減少內皮細胞和VSMC細胞周期蛋白D1表達〔18〕。綜上所述，轉錄因子 KLF4對維持VSMC內環境的平衡是必不可少的。

2.2KLF4與巨噬細胞 內皮下的巨噬細胞是泡沫細胞的主要來源。巨噬細胞不同亞型極化及其作用是近年來AS病理研究的熱點，巨噬細胞主要分為經典活化的巨噬細胞M1和替代性活化的巨噬細胞M2兩個亞型。Sharma等〔19〕發現，巨噬細胞極化依賴于轉錄因子KLF4的調控。骨髓細胞或巨噬細胞KLF4缺失的APOE-/-小鼠較APOE-/-小鼠血脂明顯升高，IL-6和IL-1β促炎因子表達水平升高，AS斑塊面積增加。提示KLF4促進巨噬細胞向M2型分化，負向調控免疫應答。這表明，KLF4具有抑制血管炎癥和抗AS的作用。Karpurapu等〔20〕研究者運用非增殖性PU.1誘導的髓系祖細胞和分化的骨髓巨噬細胞模型，發現PU.1能夠特異性與去甲基化的KLF4啟動子結合，巨噬細胞分化標志F4/80表達增強。相反，敲除胞嘧啶核苷脫氨酶(AICDA)基因可抑制KLF4啟動子去甲基化，PU.1與KLF4親和力明顯下降。結果表明，KLF4啟動子通過去甲基化修飾調控巨噬細胞的活化，可能是通過胞嘧啶核苷脫氨酶發揮作用。

巨噬細胞是促進斑塊不穩定的重要炎癥細胞，微環境的變化會影響巨噬細胞活化。干擾素(IFN)-γ、脂多糖(LPS)、腫瘤壞死因子(TNF)-α下調KLF4表達，誘導巨噬細胞活化，降低斑塊穩定性，而抗炎因子TGF-β1作用則相反〔21〕。然而，KLF4與TGF-β1相互作用的分子機制尚不清楚。Feinberg等〔21〕研究發現，KLF4與核因子(NF)-κB家族P65共同作用于誘導型一氧化氮合酶(iNOS)啟動子，通過拮抗信號蛋白Smad3羧基端激活劑p300/CBP 抑制TGF-β1/Smad3信號通路。由此證明，KLF4在調控促炎癥反應巨噬細胞發揮重要作用，同時可以作為調控 TGF-β1/Smad3信號通路的靶點。此外，其他研究從促進脂質代謝方面闡述了KLF4在巨噬細胞中的意義。 Stavri等〔22〕發現，單核細胞向巨噬細胞分化時，高表達的KLF4與CAMP反應元件結合蛋白(CREB)協同激活載脂蛋白(APO)E基因啟動子，抑制斑塊的進展并減少并發癥的發生。提示以KLF4為靶點調控巨噬細胞APOE基因表達，改善脂質代謝內環境，將為抗AS治療提供更有效的方式。

2.3KLF4與血管內皮細胞 KLF4表達于血管內皮細胞的細胞質和胞核，在調節血管生物學功能中起重要作用。缺失KLF4的內皮細胞或造血細胞可上調黏附分子的表達，促使AS斑塊巨噬細胞聚集，浸潤的炎性細胞以旁分泌的方式促進SMC增殖，誘導損傷的新生內膜形成〔23〕。KLF4高表達可下調TNF-α誘導的血管細胞黏附分子(VCAM)1的表達，并能抑制內皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血栓調節蛋白(TM)的表達并能減少促炎細胞因子產生，具有抗炎、抗血栓作用〔24〕。研究發現，運用siRNA技術沉默 KLF4基因的小鼠較控制組血管內皮鈣黏蛋白的表達減弱，內皮細胞通透性增強，小鼠更易出現肝損傷、肺水腫〔25〕。結果表明，KLF4具有維持內皮細胞屏障功能的作用。他汀類藥物上調內皮細胞抗AS基因與KLF家族轉錄因子相關〔26〕。為明確基因調控的機制，研究者對人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)給予他汀類藥物處理后進行微陣列分析，發現KLF4是高度誘導基因，靶點則是位于其近端啟動子區域的肌細胞增強因子(MEF)2。由此可見，KLF4將是他汀類藥物調節內皮細胞的一個新的轉錄因子。

NF-κB是調控炎癥、凋亡、自噬過程的中樞，選擇性抑制SMC NF-κB信號通路，能減弱SMC表型轉化和新生內膜形成。并且，NF-κB與KLF4同時參與內皮細胞表達黏附因子、巨噬細胞遷移的調控，但是兩者之間的作用方式具有細胞選擇性，如在SMC中兩者具有協同作用，而在內皮細胞和巨噬細胞相互拮抗〔27〕。

2.4KLF4與淋巴細胞 TH17是新近發現的一種CD4+細胞亞型，在炎癥性疾病、自身免疫性疾病扮演重要作用。初始CD4+細胞向其他T細胞亞型分化受到特異性轉錄因子調控。研究者〔28〕發現，KLF4能與TH17 細胞啟動子結合，表明KLF4能直接調控TH17細胞分化。并且，在敲除KLF4基因小鼠體內發現，調控TH7細胞的重要轉錄因子維甲酸相關孤核受體(ROR)yt表達上調，這表明KLF4與RORyt兩種轉錄因子在調節TH17細胞分化方面分別發揮作用。

3 展 望

AS是多種細胞及細胞因子參與的慢性血管炎癥性疾病，其中斑塊的形成是AS的標志。如何減緩斑塊的形成和破裂，減少并發癥的發生仍是目前最大的難題。大量研究表明，KLF4具有調節SMC增殖和分化、抑制巨噬細胞發揮炎癥效應、維持內皮細胞的正常功能等多種生物學效應，從而減輕炎癥和增強斑塊穩定性，以KLF4為靶點將會為治療AS帶來新的曙光。但是，KLF4調控AS斑塊浸潤的不同細胞的分子機制及是否能誘導SMC向其他細胞表型定向轉化等一系列問題仍需大量的研究驗證。

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