可降解生物鎂合金在動物體內(nèi)的溶血及過敏試驗

崔志瓊 楊 濱 甘佼弘 林 欣 徐 晟 劉 璽 張海娜 郭 振 王曄玲

(吉林大學第一醫(yī)院心血管疾病診療中心，吉林 長春 130021)

冠狀動脈疾病的發(fā)病率逐年提高，成為威脅人類生命安全的一大主要疾病，而治療心血管疾病最常見有效的治療措施為血管支架的植入，該方法可以將病灶部位血管撐開，促使其恢復正常，從而能緩解患者癥狀，避免病情的進一步發(fā)展〔1,2〕。現(xiàn)有的不可降解支架如金屬支架、覆膜支架在經(jīng)過多年的臨床應用，因其存在易致血栓形成，再狹窄率高，長期抗血小板治療及永久保留體內(nèi)等不足，使得人們將目光轉(zhuǎn)向生物可降解支架，其能夠克服部分永久性或者藥物洗脫性支架的不足，為血管再次介入手術(shù)提供了手術(shù)平臺〔3～7〕。可降解金屬支架作為新一代血管支架，可在早期為損傷血管提供足夠的力學支撐，在不引起局部和系統(tǒng)毒性的前提下，其完成血管修復任務后以合適的速率可被機體降解吸收〔8〕。目前主要有鎂合金、鐵合金和鋅合金3類可降解金屬支架材料〔9〕。近年來鎂合金支架發(fā)展較為迅速〔10～15〕，鎂合金具有密度低、強度高、生物相容性優(yōu)良、抗血小板聚集性，以及可在體內(nèi)降解的優(yōu)勢，其降解產(chǎn)物對生物體無毒性，且會通過人體正常的新陳代謝途徑排出〔16～18〕。因此，可降解醫(yī)用鎂合金也被譽為“革命性的生物金屬材料”而受到全世界的關(guān)注。本實驗對吉林大學工程仿生教育部重點實驗室的可降解生物鎂合金進行研究，觀察其在動物體內(nèi)溶血及過敏試驗的表現(xiàn)。

1 材料與方法

1.1材料、動物及主要試劑與儀器 可降解生物鎂合金(Mg-Sn-Zn)，來自吉林大學工程仿生教育部重點實驗室。實驗動物：①EWG/B豚鼠，雌雄各半，體重250～340 g,用于皮膚致敏試驗;②日本大耳白家兔(CBWR/B)，體重2.3 kg，用于體外溶血性試驗。試劑與儀器：2,4-二硝基氯苯，LDZ5-2型普通離心機，DR-HW-1電熱恒溫水溫箱，高壓滅菌機(韓國)。

1.2可降解生物鎂合金浸提液的制備 取可降解生物鎂合金材料數(shù)枚(20 mm×8 mm×2 mm)放入滅菌離心管中加入蒸餾水，超聲清潔機清洗10 min后取出晾干，121℃高壓滅菌20 min后烘干置于無菌的錐形瓶中，按照ISO文件要求(試樣表面積/浸提介質(zhì)=3 cm2/ml),加入生理鹽水，放在37℃培養(yǎng)箱中浸提72 h,得到可降解生物鎂合金浸提液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3實驗方法

1.3.1皮膚過敏試驗 將40只豚鼠按體重性別隨機分成3組：實驗組即可降解鎂合金浸提液組20只、陽性對照組為2,4-二硝基氯苯組10只、陰性對照組即生理鹽水組10只，每組豚鼠雌雄各半。致敏：將實驗組動物背部左側(cè)脫毛備皮，去毛區(qū)每側(cè)約3 cm×4 cm。24 h后將浸提液滴于紗布上制成的敷貼貼于去毛區(qū)皮膚上，用無刺激性膠布和固定帶固定6 h，第7、14天以同樣方法將浸提液紗布敷貼于豚鼠左側(cè)背部〔19～21〕。用生理鹽水作為陰性對照，陽性對照組采用2,4-二硝基氯苯配制成1%的致敏濃度，按照上述方法進行實驗。激發(fā)：第28天時，實驗組動物背部同樣方法右側(cè)脫毛備皮，24 h后將浸提液紗布敷貼于去毛區(qū)皮膚上，固定6 h后去除敷貼片，用蒸餾水清洗給藥部位后24、 48、 72 h觀察豚鼠皮膚局部過敏反應情況；陽性對照組用2,4-二硝基氯苯配制成0.1%的激發(fā)濃度，陰性對照組用生理鹽水，方法同上〔21〕。根據(jù)皮膚過敏反應評分標準評分，按致敏率判斷其致敏強度，過敏率=(組內(nèi)出現(xiàn)過敏反應的動物數(shù)/該組動物總數(shù))×100%。

1.3.2體外溶血性試驗 取日本大耳家兔血約10 ml，放在裝有玻璃珠的三角瓶中，振搖10 min后將纖維蛋白原去除，制備為脫纖血液，用氯化鈉注射液清洗血細胞，后以2 500 r/min離心5 min至上清液呈無色透明，再將所得紅細胞用氯化鈉注射液配成2%的混懸液，取7支試管并依次編號，1～5號管為供試品管，6號管為陰性對照管，第7管為陽性對照管，依次加入2%紅細胞混懸液和生理鹽水或蒸餾水〔21〕。將各管輕輕搖勻后，放置于37℃恒溫水浴中并記錄30 min及1、2、3、4 h的結(jié)果。結(jié)果評判標準：①溶血：溶液呈透明紅色；②紅細胞凝聚：溶液中有棕紅色或紅棕色絮狀沉淀；③無溶血：紅細胞全部下沉，上層液無色澄清。

2 結(jié) 果

2.1豚鼠皮膚過敏試驗 實驗組及陰性對照組在去除敷料后24、48、72 h的觀察結(jié)果均為皮膚無明顯改變，無紅斑及水腫；陽性對照組在去除敷料后均不同程度出現(xiàn)紅斑及水腫。實驗組與陰性對照組的皮膚致敏反應計分均為0,致敏率為0；陽性對照組致敏率為100%,表明其具有極強致敏性。

2.2體外溶血性試驗 蒸餾水組溶液呈透明紅色，表明其發(fā)生了溶血；生理鹽水及生物鎂合金浸提液組均可見紅細胞全部下沉，上層液無色澄明，未見棕紅色或紅棕色絮狀沉淀，二者在觀察期內(nèi)均無溶血及紅細胞凝聚，表明降解生物鎂合金浸提液對家兔紅細胞無溶血作用。

3 討 論

目前全球冠心病患病率逐年增加，血管支架植入被認為是最重要、最有效的心血管疾病診療技術(shù)。臨床醫(yī)療界對血管支架的需求推動了支架類產(chǎn)品的發(fā)展創(chuàng)新。傳統(tǒng)不可降解金屬支架及藥物洗脫支架存在長期植入引起的慢性炎癥、支架內(nèi)再狹窄、晚期支架血栓等弊端，可降解支架具有克服上述問題的潛在優(yōu)勢，在未來心血管疾病方面將發(fā)揮重要作用，因此作為新一代血管支架已得到人們廣泛關(guān)注。因其直接關(guān)系到使用者的生命安全，其安全性問題更加引起民眾的關(guān)注。因此，對其安全性評價尤為重要。

鎂是人體所必需的一種微量元素，是人體中幾種酶的必需元素，是ATP 酶的輔因子， 它具有穩(wěn)定細胞膜和影響神經(jīng)肌肉傳導和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，與生命的維持、身體的健康有著極其密切的關(guān)系，而且參與心血管活動的多個過程，主要為抗心律失常、預防動脈粥樣硬化，其抗心律失常作用常被應用于臨床治療急性心肌梗死。主要機制如下：鎂離子和鈣離子相互拮抗，通過競爭離子通道和特定結(jié)合位點，鎂離子可以抑制其進出肌質(zhì)的活性，從而抑制心肌細胞線粒體鈣離子過載引起的心律失常；鎂可以減少冠狀動脈痙攣從而改善局部心肌血流，此外鎂影響血液凝固，抑制血小板聚集，降低高密度脂蛋白含量，抑制脂質(zhì)在動脈壁的沉積從而預防動脈粥樣硬化〔22〕。然而，純鎂化學性質(zhì)活潑，在體內(nèi)降解速率過快，鎂合金則兼具優(yōu)良的機械性能和可調(diào)控降解的特性，溶出的金屬離子還可以被生物體吸收或排泄，最終在人體完成自身修復時完全降解消失〔23〕，人們開始探索將可降解生物鎂合金用于生物醫(yī)學領(lǐng)域。本文結(jié)果顯示生物鎂合金浸提液，對皮膚無潛在致敏性，對家兔紅細胞也無溶血作用，說明可降解生物鎂合金支架是一種很有前途的生物可降解支架醫(yī)用材料。