貓ω干擾素研究進展

孫明潔，董國英，張雪竹，胡桂學*

(1.吉林農業大學 動物科學技術學院，長春 130118;2.北京師范大學 全球變化與地球系統科學研究院，北京100875)

干擾素(Interferon,IFN)是一種由同屬動物細胞產生，具有抗病毒作用的分泌性糖蛋白。IFN的活性作用主要受機體細胞基因組的調控，是具有病毒防御、細胞生長、凋亡調節以及免疫激活等多功能的蛋白。IFN家族的細胞因子，目前被認為是先天免疫反應的重要組成部分，也是病毒感染的第一道防線[1]。IFN因在抗病毒、免疫調節、抗腫瘤等方面具有較好的效果被視為人和動物某些疾病和病毒感染的首選治療性藥物。1957年由Lsaacs和Lindenmann首次發現了可以干擾病毒復制的生物活性物質，后命名為IFN。根據與受體相結合的方式將其分為I型、II型和III型，I型干擾素包括IFN-α、IFN-β、IFN-ε、IFN-ω、IFN-κ、IFN-δ、IFN-τ和IFN-ζ，他們可通過相同的受體(干擾素-α/β受體1 [IFNAR1]和IFNAR2)發揮一定的生物活性。Ⅱ型IFN中僅有IFN-γ亞型，由T淋巴細胞和自然殺傷細胞產生并對被感染的細胞進行識別后作出一系列的免疫反應。Ⅲ型IFN 分為IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3，通過使用特殊的受體復合物來調節機體的免疫應答[2-3]。

1985年，干擾素ω首次從仙臺病毒誘導的Namalwa細胞中克隆得到[4]。IFN-ω除了具有與Ⅰ型干擾素類似的結構外，還存在相同的理化特性，如對胰蛋白酶和溫度的高敏感性，以及在酸性條件下的pH 穩定性[5]。自IFN-ω被發現以來，因其種屬特異性及更高效的抗病毒活性，一直是國內外研究的熱點。現已鑒定出在貓科、豬、馬、兔子、蝙蝠、牛和羊中均存在IFN-ω，犬和小鼠體內并未發現[6]。1992年，貓干擾素基因被Nakamura分離得到，一年后在貓IFN-ω基礎上的重組干擾素藥物研制成功并在日本上市，主要用于治療貓杯狀病毒及犬細小病毒病。有學者還針對FeIFN-α與FeIFN-ω的抗病毒活性進行比較研究，就H9N2亞型禽流感病毒(AIV)和犬瘟熱病毒(CDV)兩種病毒而言，FeIFN-ω的抗病毒活性比FeIFN-α高160倍和4倍[6]。近20年來，對于貓IFN-ω的研究雖已開展，但其研究的深度和廣度仍比較有限，且難以廣泛應用于臨床治療。鑒于貓IFN-ω所顯示出高效、廣譜的抗病毒能力，探索貓IFN-ω的抗病毒作用機制及其對貓病毒病在實際治療上的深入研究至關重要。本文結合IFN-ω的相關研究成果對貓ω干擾素的結構特征、生物學活性及其臨床上的應用進行綜述，以期為臨床上貓及其他動物病毒病的干擾素治療提供參考。

1 貓ω干擾素(FeIFN-ω)的結構特征

FeIFN-ω的基因結構與其他分泌蛋白基本相同，可分為5’端編碼區、信號肽編碼區、成熟肽編碼區和3’端非編碼區。其中5’端非編碼區中含有與基因轉錄的起始、調控與識別有關的序列。不同干擾素信號肽數目不同，FeIFN-ω中含有來自殘基1～23的氨基末端分泌信號序列[7]。其作用是利用疏水性，使干擾素前體與細胞膜結合，最終將成熟的干擾素分泌至細胞外。綜合其他IFN-ω的結構特點，FeIFN-ω基因結構中無內含子和轉錄因子結合位點，且缺乏最終保守密碼子，即139位脯氨酸密碼子。含有幾個保守的與生物活性至關重要的殘基，如161位的精氨酸，1、99和100位的半胱氨酸殘基，7個脯氨酸(4個位于成熟蛋白的4、26、39和117)[8]。與其他哺乳動物不同的是，FeIFN-ω的13個亞型中，均沒有N-糖基化識別位點。FeIFN-α與FeIFN-ω的同源性為94%，雖然兩者之間的同源性很高，但它們之間的抗病毒、抗增殖以及免疫調節的活性存在著巨大差異，這可能與FeIFN-ω在C端含有6個額外保守氨基酸序列，除此之外，在FeIFN-ω2和FeIFN-ω4亞型中的109位有7個新的氨基酸的插入，插入位置與FeIFN-α相同，這使得FeIFN-ω具有比其他亞型更有效的抗病毒活性[9-10]。

2 FeIFN-ω的生物學活性

2.1 FeIFN-ω抗病毒作用機制 正常細胞中，IFN基因及其復制酶系統處于抑制狀態，當細胞感染病毒后，細胞自身產生特殊因子，可以與IFN基因抑制物相結合，IFN基因抑制狀態解除，產生的IFN首先與特定的細胞表面受體相互作用，后誘導IFN刺激基因(ISGs)的表達，其中一些如信號蛋白、轉錄因子和凋亡蛋白等可以編碼抗病毒的效應物或者趨化因子，可以進一步調控IFN的信號傳導，IFN-ω還可以誘導MX1、ISG15、IFIT3和ISG56基因的轉錄[11]。通過干擾素介導的信號轉導激活I型干擾素的主要通路—JAK-STAT通路，進一步誘導抗病毒蛋白的產生，達到破壞病毒增殖的目的。抗病毒系統主要分為三種，2'-5'寡腺苷酸合成酶/RNaseL系統：該系統包含2'-5'寡腺苷酸合成酶、RNA酶L、2'-5'腺苷磷酸二酯酶三種獨立的酶，病毒源的dsRNA可導致RNaseL的活化，RNaseL可降解單鏈RNA，從而抑制以RNA作為中介的病毒復制，2'-5'寡腺苷酸二酯酶通過催化2'-5'寡腺苷酸的降解調節整個抗病毒過程；MX系統：可在轉錄水平通過干擾病毒聚合酶活性，干擾負鏈病毒的復制，其具體機理尚不完全清楚；PKR系統：PKR的基因表達是IFN通過刺激啟動子區ISRE與GAS介導完成的。PKR的氨基末端的2個保守的dsRNA結合位點，能導致PKR的構像結構改變，從而激活酶活性，迅速刺激PKR基因的表達，達到抗病毒作用[12]。總之，IFN-ω發揮抗病毒作用，主要是通過抗病毒基因表達使細胞達到破壞病毒增殖的狀態達成的。

Ⅰ型干擾素受體(IFNR)在抗病毒作用機制中，也起著至關重要的作用。所有Ⅰ型IFN只與IFNR結合，相互競爭IFNR上的結合位點，不同的IFN-IFNR復合物會啟動不同的信號傳導途徑。有研究表明feIFN-α與 feIFN-ω在IFNAR2上有不同的結合位點，且feIFN-ω與IFNAR2的相對親和力更高，這表明抗病毒活性可能與IFN與IFNR間的親和力有關[13]。

2.2 調節先天免疫反應 有證據表明FeIFN-ω可能與非特異性免疫反應有關，可使急性期蛋白(血清淀粉樣蛋白-A、α-1糖蛋白和C反應蛋白)的存活時間增長，巨噬細胞的吞噬活性及自然殺傷細胞的活性均增加，機體病毒的排泄量減少[14]。同時增加的ISG、Mx蛋白和ZAPS的數量，增強先天免疫信號傳導，這一系列的變化表明IFN-ω可以引發機體的先天免疫反應，增強巨噬細胞對抗原的吞噬能力。Leal等用IFN-ω處理細胞后，Mx-1、ISG15、IFIT3和ISG56因子的表達量均呈上升趨勢[15]。用重組貓IFN-ω(rFeIFN-ω)通過皮下注射或口服的方式處理感染貓免疫缺陷病毒(FIV)實驗組動物，結果顯示rFeIFN-ω可以顯著影響IL-6的產生。皮下注射組動物體內IL-6血漿水平降低，原病毒載量增加，而口服組中IL-6 mRNA表達量降低。然而，該療法對已達到病毒血癥期的動物及其他細胞因子(IL-1、IL-4、IL-10、IL-12P40、IFN-γ和腫瘤壞死因子-α)的表達沒有影響[15]。因此，FeIFN-ω可以參與先天免疫，并且可以進一步抑制病毒復制并發揮其抗病毒活性，但其具體的調控方式尚未明確，有待進一步研究。

2.3 抗增殖和抗腫瘤活性 大量動物試驗表明，IFNs具有誘導細胞分裂周期停滯和細胞凋亡的抗細胞增殖作用，該作用可從一個細胞向臨近的細胞移動，從而達到抑制腫瘤生長及復發轉移的作用[16]。IFNs還可以直接抑制自身惡性細胞增殖，或者通過間接調節細胞毒效應細胞，達到抗腫瘤效應。當rFeIFN-ω用于治療貓乳腺癌細胞時，呈現出了劑量依賴性、物種特異性以及靶細胞特異性，且可以與其他常規抗癌藥物共同作用，可以更好的發揮藥性。該研究證明，rFeIFN-ω有著出色的抗腫瘤活性，具有可以成為貓乳腺癌首選治療藥物的潛質[17]。

3 rFeIFN-ω的臨床應用

隨著進一步研究，探索出更多FeIFN-ω及rFeIFN-ω在臨床上還可以治療的其他種屬動物病毒性疾病迫在眉睫。有研究將FeIFN-ω序列與桿狀病毒載體構建出的重組質粒在家蠶幼蟲中表達，所制成的rFeIFN-ω作為免疫調節劑已在日本和澳大利亞等國用于治療貓細小病毒(FeLV)、犬細小病毒(CPV)及和貓免疫缺陷病(FIV)。有實驗證明該重組干擾素還可用于治療貓杯狀病毒(FCV)和貓皰疹病毒-1(FHV-1)，且可獲得較好的療效[18]。rFeIFN-ω的治療可分為三個療程，每天5次皮下注射(1 MU/kg)，分別從第0、14和60天開始進行治療[19]。 然而，由于該治療方案相對昂貴耗時，且皮下給藥伴有一些輕微的如發燒、嗜睡、腹瀉和嘔吐等不良反應使其在臨床上的進一步推廣受到了限制。目前有研究提出可以用口服或粘膜給藥的方式替代皮下注射，解決了皮下注射產生的副作用，這一研究使rFeIFN-ω在獸醫臨床中的應用成為可能，但如何更好的增強rFeIFN-ω的治療效果、降低的生產成本，成為未來研究的新方向。

4 FeIFN-ω及rFeIFN-ω對常見貓病毒病影響的研究

FCV是貓常見病原體，可導致口腔潰瘍或上呼吸道疾病，嚴重時引發致命性全身性疾病。目前仍然沒有可以直接用于治療FCV的抗病毒藥物。Lee等通過研究證明，紅參提取物或者人參皂苷可以使IFN-ω、Mx等細胞因子的相對表達量顯著上升，以此來抑制FCV病毒的復制，達到免疫效果[20-21]。rFeIFN-ω對FCV陽性貓也具有一定的治療效果，有研究利用rFeIFN-ω對160只陽性貓進行治療，靜脈注射2.5或5 MU/kg rFelFN-ω每日3次，7 d內觀察其臨床癥狀有所改善，幼貓無法進食的現象有所緩解。部分研究證明，rFelFN-ω也可以通過抑制FHV-1的復制達到治療效果。一項研究中，用注射劑量為0.5 μm/mL的FelFN-ω對20只感染FHV-1的幼貓進行治療，3周后觀察眼部癥狀明顯緩解。但在2007年巴林等的研究中，用rFelFN-ω對貓進行治療，7 d后實驗組動物的急性病毒性上呼吸道疾病的臨床癥狀并沒有得到改善[22]。因此，還需要更多研究來驗證rFIFN-ω在體內有治療FHV-1的作用。

FeLV屬于內源性逆轉錄病毒，可引起多種免疫抑制性疾病，如嚴重厭食癥、缺鈣和漸進性虛弱[23]。有研究用rFelFN-ω處理被FeLv感染的FL74細胞，評估細胞感染病毒顆粒的數量，結果發現rFelFN-ω降低了逆轉錄酶的活性[24]，這表明rFelFN-ω可以通過影響FeLV的轉錄來抑制病毒增殖，并增加了感染細胞中細胞凋亡和死亡率，從而達到治療效果[25]。同屬貓免疫系統疾病的FIV是一種貓慢性病毒，于1987年首次發現，其基因組結構與人類艾滋病病毒相似。全球大約有7%的貓存在同時感染FeLV與FIV的現象[26]。rFeIFN-ω可顯著降低感染貓的臨床評分和死亡率，并改善異常血液學參數(紅細胞計數、紅細胞壓積和白細胞計數)，口服rFelFN-ω也可使感染FIV的貓臨床癥狀得到改善，雖然機體內的病毒載量并沒有顯著變化，但仍可證明口服rFeIFN-ω可使機體獲得有效的免疫調節，可能成為治療FIV病毒的有效替代藥物[27]。

貓慢性齦口炎綜合征(FCGS)是一種多因素誘發疾病。Hennet等研究表明，口服rFeIFN-ω可有效緩解FCGS的尾部造口性牙髓炎及牙齦炎等臨床癥狀，相比于常規皮質類固醇具有更好的鎮痛效果。同時它對患有FCGS的II型糖尿病貓也有一定效果，口腔癥狀及所需的胰島素劑量與干擾素的治療劑量呈正相關，與Hennet等的研究結果一致，表明口服干擾素可以總體緩解FCGS所造成的疼痛感[28]。貓傳染性腹膜炎(FIP)是一種由貓冠狀病毒引起的免疫介導疾病[29]。有研究顯示，12只疑感染FIP的貓，每隔1 d用106U/kg的FeIFN-ω治療，癥狀緩解后，改為每周注射1次，經治療后其中有4只壽命超過兩年。Ritz等在進行的后續研究中，增加了空白對照組，但干擾素組與對照組治療的貓的存活時間之間沒有明顯差異，但 FeIFN-ω治療組淋巴細胞計數明顯降低，FeIFN-ω組的1只貓存活>3個月。這些結果表明，FeIFN-ω也可能治療FIP但劑量和免疫途徑還有待進一步研究[30]。

5 結 語

干擾素是所有抗病毒藥物中最為廣譜、高效、生物學活性廣泛的特效治療性藥物。除了抗病毒、抗增殖和抗腫瘤作用外，還具有可以刺激多種免疫細胞如NK細胞、T細胞、巨噬細胞的產生，誘導細胞凋亡基因的表達以及調節細分化的特點，其制劑的毒性和副作用較低，具有極大的研究及推廣潛力。目前已知的FeIFN-ω及其基因工程制品，在臨床中僅被注冊用于治療FeLV和FIV感染，但已有實驗證明，其在治療其他病毒感染或疾病如：FCV、FHV-1、FIV、FCGS及FIP時仍有著相當大的治療效果，且療效優于當前普遍臨床用FeIFN-α。因此，進一步對FeIFN-ω的調控機制、生物學活性、貓源病毒及其他種屬病毒的抗病毒活性的探索至關重要。

雖然，它還存在著長期注射治療導致治療成本高昂，副作用大，且在高劑量使用時的安全性仍待研究證實等缺陷，但諸多優點使其仍擁有巨大的臨床應用價值。總之，FeIFN-ω的進一步研究對貓及其他各類動物疾病的預防與治療發揮重要的作用，相信不久的將來價格低廉的干擾素將在臨床上得以廣泛的應用。