雙液相系統酶化學技術制取茶色素

摘要：在本次實驗研究中，我們利用了雙液相媒化學技術來制取茶色素，并且以單液相系統進行茶多酚酶促氧化，進而將單液相制取茶色素作為對照組。在加入氧載體之后構成了雙液相酶化學氧化系統，其中對溶解氧濃度，茶黃素類（TFs）含量，高效液相圖譜分析，茶多酚氧化酶（PPO）和茶紅素類進行分析。最終，我們在合成制品中TFs的高效液相色譜的研究中發現，TOP1和TFs的響應值以及峰面積均要高于TOP2制品中的TFs，尤其是TFG與TFDG這兩者的響應值較高，TOP-1的制品中兒茶素類殘留量相比對照組來說較少，尤其是簡單兒茶素的殘留量更少。

關鍵詞：雙液相;酶化學;制取;茶色素

一、 國內外茶色素制取的現狀

茶色素是茶葉中一種獨特的多酚類氧化縮聚物，是利用茶發酵而形成的茶色素，具有抗氧化和清除體內自由基的作用，目前已經被廣泛用于心腦血管疾病治療，動脈粥樣硬化治療。降低血壓、血脂等藥物的研究中，可以從紅茶中提取有茶色素，但是這種方法獲取的茶色素效率較低，提取質量較差，而且分離純化難度較高。近年來，國內外采用了體外酶促模擬發酵的方法或者通過有機合成來進行茶色素的形成與制取，且已經取得一定的成就。由于酶具有高效性和專一性催化，研究學者高度重視酶的反應特征，通過利用酶反應催化以及微生物來進行化學合成，并將其作為新的酶工程研究——酶化學技術。目前在有機合成的研究中，酶的使用范圍不斷擴大，尤其是在一些手性化合物的合成中，酶起到了關鍵的作用。比如茶黃素類的合成，利用PPO能夠高效制取，兒茶素結構中的C2—H與C3—H鍵的存在能夠保留在茶黃素的結構中。酶化學技術通常是在水介質中進行，在該介質中制取茶色素溶氧量較低，而且氧氣作為茶色素形成的重要底物之一，由于溶氧量受到限制而抑制了茶色素的形成。為了增加溶解氧濃度，在單液相中加入與水不相溶的有機液相，這樣構成了雙液相系統，經過研究發現，在茶多酚酶促氧化條件下，相比單液相來說，這種雙液相系統的溶氧量提高了兩倍多，而且酶的穩定性也相對增強，活性提高了百分之兩百。自20世紀50年代以來，國內外有關學者針對茶發酵實質以及反應機理展開研究，茶葉勻漿懸浮液的發酵，體外酶性或者一些非酶性的氧化兒茶素，進而制取茶色素。但是在雙液相系統中，通過酶化學技術制取茶色素的相關研究比較少。在雙液相體系中，我們應用酶來催化氧化茶多酚，進而制取茶色素，尤其是制取一些含有較低濃度咖啡堿，而高濃度茶黃素的生物活性的茶橙素制品，目前已經取得了不錯的成績。

二、 研究方法

在本次研究過程中，我們所需要的有機溶劑均為分析純，包括乙酸乙酯，正丁醇，油酸，正己烷等，利用吸附樹脂NKA=9的柱子進行分離制備茶色素。所使用的儀器有：溶氧分析儀，生物反應器，LZB型玻璃轉子流量計。

在具體的方法中，我們利用了雙液相酶化學技術來制取茶色素。首先稱取5克的茶多酚，加入500mL檸檬酸——磷酸氫二鈉的緩沖液中，最終調節pH為5.6，溶解之后加入500mL的OV-4以及40mL的酶制劑，通入每分鐘20mL的氧氣，在27℃的溫度下進行酶促反應，經過1.5小時之后反應完成，分離油相，利用旋轉蒸餾濃縮干燥獲得茶橙色素，（TOP-1）水相經過吸附樹脂柱層析春花看，用80%的乙醇洗脫，經過減壓蒸餾濃縮后得到茶紅色素。在對照組實驗中，我們利用了單液相酶化學技術來制取茶色素，這里的方法如上述所示，但是我們沒有添加氧載體OV-4，最終制得的樣品為茶橙素和茶紅色素。提取分離茶多酚氧化酶，通過雙液相系統中多酚氧化酶的活性進行測定中，由于在雙液相系統中，酶主要分布于水相中，在水相中進行氧化催化實驗，由于反應中存在大量的茶多酚底物，在測定茶多酚氧化酶活性時，需要進行去除。具體方法是將聚酰胺柱子中加入 5mL 的反應液，流出濾液中不會顯示酚性反應，取3mL的氯液用于茶多酚氧化酶活性分光光度計的測定，利用高效液相色譜分析茶色素和兒茶素。

三、 研究結果

1. 篩選雙液相的油相。再利用單液相系統制取茶色素過程中，由于水中溶解氧的含量不足，而導致茶色素形成受到限制，在1984年Robertson A的實驗表明，茶葉體外酶促氧化過程中體系中，有由于溶氧量較低，在20℃時，每個大氣壓溶氧量僅能達到3%，而其實茶葉體外外酶促氧化過程中20%的溶氧量是反應的最適濃度。在雙液相系統中，由于加入了油相而提高了氧氣的溶解量，有效解決了上述氧氣不足的問題。因而油相的篩選是比較重要的。茶色素可以分為藥用色素和天然食用色素，再進行油相篩選過程中，應當考慮到經濟因素，篩選出一些溶氧量較高，茶多酚容量大，茶多酚氧化酶和分布較好，穩定性強，活性較高，且對環境沒有污染，無毒，成本低，易回收的有機溶劑。經過對多種有機溶劑進行實驗，我們最終認為OV-4作為氧載體是比較好的，分別對茶多酚氧化酶和溶氧量濃度，茶色素的形成量進行分析。

2. 水相中OV-4的體積比以及溶氧量的變化。在之前的研究中，我們發現在有機溶劑中，氧氣的溶解度遠遠高于水中，因而采用水相-油相的雙液相體系能夠大大增強氧氣的溶解量，提高氧的傳遞效率。我們將對氧氣較高溶解度而不溶于水的有機溶劑中氧載體。而OV-4就是一種比較好的氧載體。研究表明，有機溶劑OV-4的鋪展系數為正，其體積傳遞系數會隨著油相體積百分數增大而增大，而且與此同時，氧溶量也會增加，當油相體積比達到25%以上時，溶氧量增加會變慢。

3. 溶氧量對于茶色素形成的影響。在進行制取茶色素的過程中，氧氣是茶多酚氧化反應中重要的底物，由于茶多酚氧化酶對于氧存在較大的米氏常數，低氧濃度不利于兒茶素的酶促氧化過程，尤其是EC和ECG不能與EGC與EGCG這些進行配對縮合姘環反應，而導致茶黃素合成受到抑制，進而茶紅素的合成也會受到一定的影響。然而，在雙液相系統制取茶色素時，由于增加了溶解氧的供給，進而提高了酶促氧化的反應過程，提高了茶黃色和茶紅素的合成含量，具體的實驗數據如下表所示。

表1水-OV-4雙液相體積與溶氧量

油相/水相（v/vx100）溶氧量（mg/L）05.21012.11514.22016.53018.54019.55020表2供氧量與TFs形成含量

反應時間水-OV-4雙液相單液相溶氧量TFs含量溶氧量TFs含量0————0.513.4801.271122.81603.8781. 524.61908.480225.221411.880324.82389.878從表中我們發現雙液相系統制取茶色素過程中，隨著不斷通氧進行酶促氧化反應，溶氧濃度迅速增加，進而茶黃素的含量也不斷累積，在反應后三小時，茶黃素的和茶紅素合成速度會達到高峰，也證明在雙液相系統中，當氧氣的流速為每分鐘20mL是最適反應條件，在這個條件下茶黃素的含量是利用單向系統合成茶黃素的三倍，在單液相體系中，雖然溶氧量也有所提升，但相比雙液相溶氧量來說，僅為20%以下，從而從一定程度上抑制了茶色素的形成。

4. 雙液相系統中茶多酚氧化酶的活性。在雙液相系統中由于增加溶氧量，而使得茶多酚氧化酶的活性得以提高，經過研究，我們發現在雙液相系統中茶多酚氧化酶，由于催化茶多酚形成茶色素，經過兩個小時的反應時間后，茶多酚氧化酶的活性達到最大值之后，活性會逐漸降低，在反應三小時之后，茶多酚氧化酶的活性為135%，然而在單液相系統中，茶多酚氧化酶的活力是逐漸降低的，在反應三小時之后酶的活性僅為雙液相系統的一半。

5. 底物的濃度對茶色素形成的影響。在茶色素的反應過程中，隨著底物濃度增大，茶色素的合成率也相應增加，但當底物濃度達到某一高濃度時，對茶多酚氧化酶的活性產生抑制，因此在制取茶色素的過程中，應當選擇適當的底物濃度，在雙液相反應系統中，70%的底物茶多酚會進入油相，其余30%進入水相，茶多酚氧化酶會進入水相，因而茶多酚氧化酶催化氧化茶多酚的反應發生在水相，其產物主要分布在水相，然而茶色素卻進入了油相，活躍平衡分布，比如水相中茶多酚經過氧化之后，會從油相中得到補充。國外研究學者在體外模擬發酵和酶催化查茶兒茶色素形成茶色素時，采用的是1%的茶多酚濃度，而在雙液相系統的研究中，我們利用了2%的茶多酚濃度。在過去的研究中表明，在雙液相系統中酶的平衡理論和動力學，可以將該理論用于實踐指導。

6. 茶色素制品的化學成分。天然制成的茶色素中主要的成分包括TFs和TRs，茶色素制品根據工藝流程獲得的茶橙色素與紅色素中，茶橙色素的主要成分為TFs和TRSI，而茶紅色素的主要成分為TRSII和TRSIa。我們在本次實驗中，主要分析茶橙色素的化學組成，通過高效液相色譜分析發現，在雙液相系統中茶橙色素與單液相制品中的茶色素的化學成分，吸收峰能夠明顯辨別，通過保留時間可以發現其與茶紅色素的組成成分是比較相似的。尤其對于TFs的成分來說，它們的響應值是重疊的，而TRSI的組成成分相比茶紅色素來說大大降低。

茶色素中主要包括了茶黃色素和茶紅色素，而茶黃素類包括了茶黃素與茶黃酸，茶紅素類包括多種成分，它們的色譜行為與光譜特征均有所差異。茶黃素類是一種苯苯駢草酚酮的衍生物。苯駢草酚酮的核上具有多個酚羥基和羰基。其中通過C2—C6以及C2—C4化學鍵可以與兩個苯駢二氧吡喃環相連接，雖然是單鍵相連，但由于受到空間位阻的影響，而使得自由旋轉受阻，具有一定構象，具有特異的生理活性，比如能夠抗凝、降低血脂等。茶黃素形成需要兒茶素與沒有食子集兒茶素配對，在B環上的鄰位二羥基與B環上連位三羥基酸配對，在茶多酚氧化酶的催化下進行氧化駢環形成。茶黃酸也屬于茶駢草酚酮的衍生物之一，它的結構中含有多個羥基、羰基和羧基。茶黃酸類極易溶于水，齊極性較大，尤其可以溶于乙酸乙酯。在過去的研究中，認為苯黃酸類在紅茶中含量較少，制茶發酵中很活躍，很容易轉化為茶紅素類。茶磺酸是由表兒茶沒食子酸質以及沒食子酸氧化瓶還而形成的。茶紅素是一種異質酚性色素物質，它的分子量不等，大概范圍為700到4萬，差異比較明顯，極性相比茶黃素類來說較強，而且化學組分結構更加復雜，至今還沒有分離出茶紅素類的單體，只是將其層析或者溶劑萃取分成若干的成分進行研究。

四、 小結

在本次研究中我們比較了雙液相系統以及單液相系統酶化學技術在提取茶色素的區別。結果發現，雙液相酶化學氧化系統中，由于茶多酚氧化酶的活性，溶解氧濃度都相應增強，因而使得最終制取的茶色素含量較高。

參考文獻：

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作者簡介：

李淑蓮，寧夏回族自治區銀川市，寧夏工商職業技術學院能源化工學院。