牡荊素對異氟烷誘導大鼠神經細胞損傷的保護作用

陳琳琳　王艷生　齊英凱

(滄州市中心醫院麻醉科，河北　滄州　061001)

術后認知功能障礙(POCD)是常出現在手術麻醉后患者中的中樞神經系統并發癥，在老年患者中尤為常見，其表現為內心焦慮、精神錯亂、記憶受損或短時間性格改變等〔1〕。POCD常導致患者的康復延遲、病死率增加，嚴重者甚至發展為阿爾茨海默病〔2〕。異氟烷(IF)是臨床上常用的揮發性吸入麻醉藥，其誘導和蘇醒過程迅速、平穩，麻醉效力強，且對循環肝腎功能影響小〔3〕。而麻醉藥物的細胞毒性和中樞神經系統抑制作用，被認為是導致POCD發生的主要原因〔4〕。研究顯示POCD可能與中樞神經系統炎癥反應有關，如促炎因子的過度釋放是 IF誘導老年大鼠認知損傷的一個重要機制〔5〕。牡荊素(VT)又名牡荊苷，是從牡荊葉、牡荊子及山楂葉中提取的黃酮碳苷類有效單體成分，牡荊苷具有抗心肌梗死、抗炎鎮痛、抗感染、降血壓、抗菌、抗氧化、抗腫瘤、抗記憶損傷和神經系統保護作用等多種藥理作用〔6，7〕。本研究旨在探討VT對IF誘導大鼠神經細胞損傷中的作用及機制。

1　材料及方法

1.1試劑及儀器IF(Baxter，USA)，VT(固體粉劑，純度：99.8%，批號：2015034，西安昊軒生物科技)，MTT細胞生長增殖/毒性檢測試劑盒(Sigma，USA)，兔抗人NSE單抗(CST，USA)，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(博士德公司，武漢)，免疫組化檢測試劑盒(福州邁新生物科技)，β淀粉樣蛋白(Aβ)1～42,腫瘤壞死因子(TNF)-α和干擾素(INF)-γ的酶聯免疫吸附(ELISA)檢測試劑盒(Sigma，USA)，Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒(凱基生物，江蘇)，奧林巴斯熒光倒置顯微鏡Olympus IX7(Olympus，日本，UIS2光學成像系統，Image-Pro Plus7.0成像系統)，Multiskan MK 3酶標儀(Thermo，USA，型號413MBY042078)，FACS Canto Ⅱ流式細胞儀(BD，美國)，Ste-phan ARTEC-C麻醉機(Drager，Ger)。

1.2海馬神經細胞的分離及原代培養雄性新生SD大鼠1只(出生24 h內，北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK(京)2016-0011)。將SD大鼠脊椎脫臼法處死，斷頭后用75%的酒精消毒，剪開腦部的皮膚后分離出顱骨，使雙側大腦暴露后，分離出雙側的大腦半球，立即轉移至含D-Hank液的培養皿中，小心分離皮層并取出海馬組織，D-Hank液中漂洗3次后分離血絲和腦膜，得海馬組織，將其用眼科剪剪成1.0 mm3小塊，胰酶消化25 min，加入含10%胎牛血清的DMEM培養基終止消化，800 r/min離心10 min，棄培養基，用吸管緩慢吹打混勻，靜置5 min，上清液即為海馬神經細胞懸液，以4×105/ml的細胞密度接種到6 cm培養皿中，置于37℃、5%CO2培養箱中培養，接種24 h將培養液全量換成無血清DMEM/F12培養液，第48小時后加入10 μmol/L阿糖胞苷抑制非神經元細胞過度生長，隨后每3 d半量換液一次。顯微鏡下觀察海馬神經細胞的形態，并采用免疫組化NSE染色鑒定。該實驗的研究方案經我醫倫理委員會批準，所有操作均符合動物倫理學。

1.3細胞及動物給藥處理體外實驗：按1.2的操作成功分離原代新生大鼠海馬神經細胞，細胞培養于涂有多聚賴氨酸的35 mm培養皿中，調整細胞終濃度為106個/ml。實驗分為空白對照組，2% IF組(IF)，2% IF+30 mg/L VT(IF+30 VT)組，2% IF+50 mg/L VT(IF+50 VT)組，2% IF+100 mg/L VT(IF+100 VT)組。2% IF由Ste-phan ARTEC-C麻醉機提供，載氣為空氣+5%CO2，空白對照組不經 IF處理，于恒溫孵育箱內正常培養，其余各組均在不同濃度的VT處理前暴露于2% IF中6 h。

體內實驗：20月齡、體重(500±50)g的雄性SD大鼠共15只，實驗大鼠分五組，每組3只，包括對照組、IF、IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT組。對照組不吸入IF，于恒溫動物房內正常培養，其余各組均在不同濃度的VT處理前置于麻醉誘導箱內統一吸入一次2%的 IF與O2(2 L/min)的混合氣體，時間為2 h。隨后在吸入 IF的第1～5天連續腹腔注射30、50、100 mg/kg的VT，每天1次。其中對照組注射等量生理鹽水溶液，不同濃度VT組則使用生理鹽水溶解。

1.4免疫組化NSE染色鑒定海馬神經細胞取培養至第8 d的細胞，將細胞直接鋪在12孔板上，用4%多聚甲醛固定后，磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3次，4%的多聚甲醛固定30 min，過氧化氫消除過氧化氫酶5 min，室溫下山羊血清封閉15 min，吸除多余液體后加NSE一抗(1∶1 000)孵育，4℃過夜，PBS清洗3次后室溫孵育辣根酶標記的二抗10 min，PBS清洗3次，采用二氨基聯苯胺(DAB)顯色，經蘇木素復染10 s后1%的HCl-C2H5OH分化，迅速用自來水沖洗，后經酒精脫水和二甲苯透明后，用中性樹膠封片，顯微鏡下采集200倍的圖像，NSE蛋白陽性表達的標準為神經元胞質及部分突起著色為棕黃色。

1.5MTT比色法檢測細胞活性實驗分組及處理方式見1.3，取培養至第8天經NSE免疫組化鑒定的海馬神經細胞，以3×104個/ml的密度接種于96孔板中，每孔200 μl，培養箱內孵育24 h后，將IF、IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT組分別置于一側帶有進氣口的透明聚乙烯塑料盒中，再置于37℃培養箱中，2% IF麻醉機提供，其中IF的載氣為空氣和5%CO2的混合氣體，氣體由密閉管道的進氣口通入，使裝有96孔板的盒子中的細胞暴露于2%IF中，而對照組則通入空氣+5%CO2正常培養，處理6 h后棄培養上清，對照組和IF組加入DMEM培養基，IF+30 VT、IF+50 VT和IF+100 VT組分別加入30、50、100 mg/L的VT，培養箱內孵育4 h后，每孔加入15 μl的MTT(終濃度為5 g/L)，繼續培養3 h后，棄上清培養液，加入200 μl的二甲基亞砜(DMSO)，振蕩混勻10 min，酶標儀上540 nm波長下檢測每孔的吸光度值，以與對照組吸光度值的百分比表示細胞活性。每個樣設置5個復孔，實驗重復3次。

1.6流式細胞術檢測細胞凋亡實驗分組及處理方式見1.3，取培養至第8天經NSE免疫組化鑒定的海馬神經細胞，以1×105個/ml的密度接種于6 cm培養皿中，每皿5 ml。采用MTT比色法體外對各組進行處理，48 h后PBS清洗細胞3次，加入0.25%胰酶，吹打至懸浮狀態，每皿加入100 μl緩沖液、5 μl Annexin Ⅴ-FITC及5 μl 0.5 mg/L PI，避光4℃靜置15 min，于流式細胞儀上檢測各組海馬神經細胞的凋亡情況。統計右下和右上象限的數值之和即為細胞凋亡的比例(早期凋亡與晚期凋亡之和)。每個樣設置3個復孔，實驗重復3次。

1.7ELISA檢測Aβ1～42、TNF-α和INF-γ的含量實驗分組及處理方式見1.2，將大鼠處死后立即取腦，冰上分離大鼠的雙側海馬，放入凍存管置于液氮中，凍存48 h后稱取各組組織100 mg，置于含2%烷基硫酸鈉和50 mmol/L蛋白酶抑制劑的PBS中，4℃、12 000 r/min離心20 min后取上清液，嚴格參照ELISA檢測試劑盒的說明書，分別進行Aβ1～42、TNF-α和INF-γ的含量檢測，將稀釋的樣品加樣并蓋上封板膜，輕搖后在37℃反應60 min，洗板5次，分別加入顯色液A和B，37℃下顯色10 min后加入終止液，10 min內讀取OD值，據此繪制濃度標準曲線，根據所測OD值找出標準曲線上對應的樣本濃度，記錄實驗結果。每個樣設置3個復孔，實驗重復3次。

1.8統計學方法應用SPSS19.0統計軟件進行分析，計量資料采用成組t檢驗，多組間數據比較經單因素方差分析和LSD-t檢驗。

2　結　果

2.1原代海馬神經細胞的鑒定結果鏡下觀察顯示海馬神經細胞的生長狀態良好，且所有細胞均胞體豐滿。NSE的免疫組化檢測結果顯示細胞的胞質和部分突起為棕黃色著色，表明本培養方法可得到純度較高的新生大鼠海馬神經細胞。見圖1。

2.2VT對 IF作用下海馬神經細胞活性的影響與空白對照組(97.67±1.20)比較，IF組細胞活性(60.33±3.28)顯著降低(t=10.681，P=0.000)。與IF組比較，IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT組(73.67±3.18、86.67±2.03)、70.33±1.20)顯著增加(t=2.917，6.825，2.860；P=0.043，0.002，0.046)。

2.3VT對 IF作用下海馬神經細胞凋亡能力的影響與空白對照組(9.41±0.30)%比較， IF組細胞凋亡率(42.54±0.75)%顯著增加(t=40.962，P=0.000)。與IF組比較， IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT組〔(31.00±0.57)%、(12.34±0.87)%、(23.70±0.90)%〕顯著降低(t=12.214，26.210，15.968；P=0.000，0.000 1，0.000)。

2.4VT對 IF作用下海馬組織勻漿中Aβ1～42，TNF-α和INF-γ含量的影響與空白對照組Aβ1～42、TNF-α和INF-γ含量(756.91±12.24，0.85±0.02，72.54±1.29)比較，IF組(1 276.00±14.37，2.15±0.08，97.91±1.50)均顯著上升(t=27.512，15.596，12.812；均P=0.000)。與IF組相比， IF+30 VT、IF+50 VT、IF+100 VT組Aβ1～42含量(916.81±44.17，tIF+30 VT=7.736，PIF+30 VT=0.002；703.71±12.24，tIF+50 VT=30.316，PIF+50 VT=0.000 1；1 053.00±28.91，tIF+100 VT=6.918，PIF+100 VT=0.002)、TNF-α(1.82±0.04，tIF+30 VT=3.654，PIF+30 VT=0.022； 1.52±0.02，tIF+50 VT=7.634，PIF+50 VT=0.002；1.57±0.03，tIF+100 VT=6.586，PIF+100 VT=0.003)和INF-γ(81.67±1.67，tIF+30 VT=7.234，PIF+30 VT=0.002；71.77±0.91，tIF+50 VT=14.907，PIF+50 VT=0.000；75.68±1.86，tIF+100 VT=9.306，PIF+100 VT=0.001)的含量均顯著降低。

3　討　論

研究顯示，吸入3% IF的大鼠其神經細胞受到明顯損傷，且學習記憶能力也受到了顯著影響，其機制可能與IF可引起炎癥反應、氧化應激或細胞凋亡等有關〔8〕。VT為黃酮碳苷類化合物，具有抗感染、抗氧化、抗凋亡等藥理作用，有一定的神經保護和抗記憶損傷作用〔9〕。

研究顯示老年大鼠在高濃度吸入麻醉藥物后，可使其神經細胞發生凋亡、導致其認知功能障礙，而許多中藥可有效地改善該過程，如姜黃素可改善高濃度吸入麻醉藥物所致的老年大鼠學習記憶力損害〔10〕、紅景天苷可改善吸入麻醉藥所致的阿爾茨海默病大鼠的認知功能障礙〔11〕、竹葉黃酮可刺激神經細胞的突觸生長，對神經細胞產生保護作用〔12〕。本研究發現VT也能顯著抑制 IF所致的海馬神經細胞的凋亡，增加細胞的活性，提示 VT可能有潛力用于POCD的防治。

研究認為Aβ的生成、聚集和沉積是認知功能損害相關疾病如POCD等的重要病理學基礎〔13〕。Aβ1～42對神經細胞有較強的細胞毒性，能使Aβ纖維聚集而產生老年斑，對人的認知功能產生嚴重影響〔14〕。已有研究顯示，2% IF處理人膠質瘤細胞可顯著促進Aβ的生成〔15〕。本研究表明2% IF處理大鼠，使大鼠海馬組織勻漿中Aβ1～42含量顯著增加，而不同濃度的VT均可顯著抑制Aβ1～42含量，說明VT可顯著改善 IF所致大鼠神經細胞損傷，該過程可能與抑制Aβ1～42的生成有關。

研究報道還認為POCD和中樞神經系統炎癥反應間存在相關性，如過度釋放的促炎因子可能使IF誘導大鼠發生POCD〔16〕。炎癥反應中發揮重要作用的TNF-α和IFN-γ能降低胰島素降解酶的表達水平，使小膠質細胞的Aβ1～42降解能力顯著降低〔17〕。本研究結果表明VT可通過增強大鼠抗感染能力、降低TNF-α和IFN-γ的含量而抑制IF所致的神經細胞損傷。

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