甜味蛋白Brazzein及其基因工程

鄭偉偉，趙萌，劉波

(齊魯工業大學 食品科學與工程學院，濟南 250353)

近些年來許多流行病的增加都與糖的攝入有關，包括肥胖、糖尿病、高血糖癥和齲齒。鑒于此，人們對于安全、健康、天然甜味劑的需求更加迫切。甜味蛋白質作為一種新型的甜味化合物，可以作為天然、低熱量的甜味劑。和蔗糖不同，甜味蛋白質不會引起體內胰島素的變化，因此，它們可能是人工甜味劑、食品和飲料行業中糖類最合適的替代品[1]。

甜味蛋白質通常是從植物中提取的小分子量多肽，它們大多具有超強的甜味，其甜味度約為同摩爾蔗糖甜味的2000～3000倍。目前研究較多的有7種甜味蛋白質：Thaumatin，Monellin，Miraculin，Curculin，Mabinlin，Brazzein以及Pentadin。相比化學合成的甜味劑，它們安全無毒；相比其他的天然甜味劑，它們能量低，又因為甜度高和可以被消化降解為人體所需的天然氨基酸受到越來越多科學家的關注[2]。在這些甜味蛋白質中，Brazzein相對分子質量最小，僅有6.5 kD，具有良好的耐熱性和耐pH穩定性，因此Brazzein有可能成為一類新型的具有發展潛力的甜味劑。

1 甜味蛋白Brazzein的來源及生化特性

Brazzein是由Ming和Hellekant從西非熱帶植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果實中分離得到的。Brazzein以2種形式存在：其主要存在形式是在氨基末端有焦谷氨酸，而少量形式在氨基末端缺少焦谷氨酸。甜味感官評價結果顯示后者的甜度是前者的2倍[3]。

Brazzein 分子是一種小分子量單鏈蛋白，它含有54個氨基酸殘基，在目前發現的7種植物甜味中Brazzein蛋白相對分子量最小，因此研究者更愿意研究它的結構。

Brazzein具有較好的溶解性，并表現出良好的熱力學穩定性和pH 值穩定性。Brazzein分子在85 ℃時仍保持折疊形式。人工合成的L-2型Brazzein具有甜味，但是合成的D-2型卻不具有甜味[4]。Caldwell等利用NMR研究了Brazzein的結構，結果顯示Brazzein包含1個短的α螺旋(殘基21～29)和3個反平行的β折疊(strand I，殘基5～7；strand II，殘基44～50；strand III，殘基34～39)，4對二硫鍵將其分子的所有二級結構相交聯(PDB:2BRZ)。

2 Brazzein甜味的決定因素

2.1 包含Arg43的彈性環周圍的氨基酸殘基

在其他的甜味蛋白中，對甜味重要的氨基酸殘基都位于彈性環區域[6]。Brazzein有1個彈性環(殘基38～45),包括Phe-Tyr-Asp-Glu-Lys-Arg-Asn-Leu序列。這個環包含Arg43,該氨基酸殘基是β轉角在strand Ⅱ和 strand Ⅲ之間的中心。有研究指出這個氨基酸殘基對于產生甜味是非常必要的[7]。此外，Tyr39, Asp40, Glu41, Lys42和Arg43這些氨基酸殘基的化學修飾，也參與了Brazzein甜味的形成。

2.2 帶電荷的氨基酸殘基

Brazzein極富電荷性和極性，它的序列包括5個天冬氨酸、2個精氨酸、4個谷氨酸、1個組氨酸、7個賴氨酸、6個酪氨酸和2個絲氨酸。這些帶電荷氨基酸殘基大約占總殘基的50%。這些殘基的大多數都靠近環或者在N-末端與C-末端區域。Ming等[8]對這些類型的氨基酸殘基進行了突變，結果顯示這些帶電荷的氨基酸殘基對于Brazzein的甜味是非常重要的。

Joo-Won Lee等[9]通過定點突變技術設計了多個突變體,他們發現所有的雙突變(H31R/E36D，H31R/E41A和E36D/E41A)甜味均比野生型、單突變的甜。而且他們還發現三重突變(H31R/E36D/E41A)的甜味明顯比雙突變的甜。這些發現表明Brazzein可能與甜味受體表面的多個位點結合。如果減少蛋白質表面整體的負電荷或者增加正電荷，就有可能增加Brazzein的甜味。同樣的帶電荷和極性的殘基對于甜味的重要性在甜味蛋白質Thaumatin和Monellin中也有報道[10]。

2.3 N-末端和C-末端

N-末端參與Brazzein的甜味。N-末端帶有葡萄球菌核酸酶(SNase)的Brazzein融合蛋白沒有甜味，因此一個體積龐大的N-末端延伸物可能抑制它與受體的相互作用[11]。靈活的C末端是Brazzein與甜味受體作用的主要位點之一，其中C末端的第53位氨基酸對于Brazzein的甜味具有重要作用。該位置氨基酸的大小和側鏈的電荷可能賦予了它與甜味受體獨特的相互作用[12]。

2.4 其他的因素

Izawa等發現化學合成的Brazzein的甜味依賴于正確折疊的結構。相似的，Kim S H等也發現當甜味蛋白質Thaumatin和Monellin蛋白沒有折疊時，甜味也沒有了。

對于Brazzein 分子中的半胱氨酸、賴氨酸、酪氨酸、組氨酸和精氨酸的化學修飾,均導致甜味的降低或喪失[13]。Brazzein 的半胱氨酸具有極為重要的結構意義,它們的還原和S烷基化將導致二級結構的解體和三級結構的破壞,從而使其喪失甜味活性[14]。

Cornilescu C等[15]發現低溫形式的Brazzein與人類T1R2甜味受體的胞外區域的結合比高溫形式結合的更緊密。因為Brazzein與溫度有關的氨基酸涉及多個位點，而這些位點對與異二聚體甜味受體的相互作用或者它的甜味都是很重要的。

3 Brazzein的基因工程

因產Brazzein 的植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon生長條件苛刻, 在原產地之外不能結實。于是人們便把希望寄托在Brazzein 的基因工程上。迄今為止,Brazzein基因已在數種微生物、真菌和高等植物表達等方面，都取得了一定進展。近幾年，國內在基因工程上主要側重Brazzein的合成和表達，而國外則側重Brazzein的突變，以尋求性質穩定、甜味更好的突變體。

3.1 Brazzein在原核生物中的表達

Brazzein在原核生物中的表達，主要集中在大腸桿菌，枯草芽孢桿菌和乳酸乳球菌。尤其是在以大腸桿菌作為表達菌的研究中，目的蛋白的產量及生物活性都有了很大提高。

李春麗等[16]于2004 年根據甜蛋白Brazzein 的成熟區氨基酸序列，按照大腸桿菌的密碼子偏好性成功構建重組表達載體pET-Bra。經IPTG誘導表達后得到了與預計分子量相同的蛋白，約占細菌可溶性蛋白的12.8%，純化后的重組蛋白的甜度約是同等重量蔗糖的600倍。張詠春等[17]于2009年在Brazzein肽鏈中引入31His -Ala的突變, 依照Bacillussubtilis的偏愛密碼子,合成了定點突變后的Brazzein 編碼序列,并在B.subtilisWB600中實現了可溶性胞內表達,得到了表達量較高的活性蛋白產物。王長遠等[18]根據乳酸乳球菌的密碼子偏好性，對Brazzein 編碼基因進行優化和突變，將優化后的基因克隆入表達載體，在乳酸乳球菌表面成功構建了Brazzein 高水平的表達系統，在乳酸菌表面得到了甜味蛋白。

3.2 Brazzein在真菌中的表達

趙紅玲等[19]于2005 年將含有Brazzein 基因的pPIC9K穿梭質粒通過電導入巴斯德畢赤酵母 GS115中，經過IPTG誘導表達后，得到的目的蛋白的分子量與理論值一致，經過小規模的發酵，目的蛋白的含量可以達到385 mg/L，純化后的目的蛋白可以嘗到微的甜味。史勇等[20]對甜味蛋白Brazzein 基因進行改造，采用重疊PCR合成目的基因并克隆到pMD18T 載體，將構建好的重組載體pGAPZαA-Bra用AvrⅡ線性化，電轉進入巴斯德畢赤酵母中。通過篩選ZeocinTM陽性克隆菌，進行蛋白表達，SDS-PAGE 結果表明蛋白表達成功。

3.3 Brazzein在植物中的表達

Tomes 等[21]曾構建了Brazzein 基因的植物表達載體，將其在植物中進行表達，但未見確定結果的報道。蔣迪[22]于2002 年人工合成Brazzein 基因，并對生菜和煙草進行了轉化，獲得了轉基因植株及其種子。郭淑華[23]利用農桿菌介導法進行了甜味蛋白Brazzein在番茄中的遺傳轉化，并利用反轉錄檢測到了Brazzein基因在轉基因果實中的轉錄表達。王克婧等[24]通過農桿菌介導法進行人參果的遺傳轉化，獲得轉化再生植株54 株，經檢測從中篩選出15株陽性植株，初步確定目的基因已經整合到人參果基因組中。雖然有報道能夠將基因的編碼序列整合到植物基因組中，也在轉錄水平檢測到了目的基因的轉錄表達，但在蛋白質水平上表達還不夠理想，這可能與基因轉錄后修飾以及蛋白質修飾有關。

3.4 Brazzein在哺乳動物中的表達

Gordon K等[25]利用轉基因的技術在小鼠的乳腺中獲得β-酪蛋白，這項技術成功促進了乳腺生物反應器相關技術的快速發展。乳腺生物反應器生產的蛋白不僅活性高，無污染，且具有蛋白的天然活性。閻森[26]在小鼠乳汁中成功表達植物甜味蛋白，并生產出具有生物活性的蛋白，對進一步利用大動物如牛、羊等大規模生產高效活性的甜味蛋白以及利用動物乳腺生物反應器表達其他植物蛋白具有非常重要的借鑒意義。安辰瑞等[27]以人工合成的甜味蛋白Brazzein 基因為基礎，成功構建了甜味蛋白Brazzein 基因的乳腺特異性表達載體。

4 研究的意義

Brazzein的研究開發還未成熟, 目前仍處在實驗室階段。但是隨著基因工程技術的發展，大規模生產重組甜味蛋白而替代從植物中提取的生產方式，必將促進甜味蛋白質具有更廣闊的發展前景。與傳統的甜味劑相比，Brazzein有許多優點。例如作為一種高甜度、低熱值的非糖甜味劑，Brazzein甜味醇厚，口感好，消化后不會引起血糖升高，不會引起齲齒，安全性好，可以用于食品中增進或改善風味。因此，研究并開發Brazzein具有極其重要的意義，相信在追求健康天然的食品市場中會有巨大的前景。

5 挑戰與前景

甜味蛋白Brazzein最終被廉價地推向食品市場, 必然會面臨許多挑戰。首先，Brazzein是從一種熱帶植物中分離得到的，但是這種熱帶植物在其他的環境很難結出果實，從而限制了它的開發和應用,利用化學合成成本又是一個關鍵性問題；其次就是Brazzein表達過程中所要面臨的技術難題；迄今為止，Brazzein已在微生物、真菌、植物和哺乳動物中進行了表達，表達產物或者產量低，或者沒有甜味，迄今尚達不到理想的效果；第三，利用基因工程生產的Brazzein最終推向市場還必須經過安全檢驗，在審批過程中，首先要對Brazzein進行毒理學檢測，將基因工程生產的Brazzein與天然Brazzein進行廣泛的比較，以確定這兩類蛋白的生物學活性是否完全一致；最后，在工業生產中甜味蛋白分離純化過程成本的控制也是亟待解決的問題。因此，最終將Brazzein廉價安全地推向市場，還有很長的路要走。但隨著生物技術的發展，克服這些困難也指日可待。Thaumatin在商業開發中的成功就是一個例證。相信在不遠的將來，通過科研工作者和食品開發研究人員的共同努力，甜味蛋白Brazzein一定能夠作為一種高效優質的甜味劑走向市場，為食品工業的發展和人類健康做出更大的貢獻。

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