鹿芪方對高血壓合并心力衰竭大鼠血壓、血管緊張素-醛固酮和心肌膠原纖維的影響*

劉 茜，周 華，瞿惠燕，戎靖楓，封 舟，王 詠

心力衰竭（CHF）是由于各種原因的初始心肌損傷引起心臟結構和功能的改變，是心臟疾病的終末階段。近年來，其發病率和病死率逐步上升。中國對35～74歲城鄉居民共15 518人隨機抽樣調查的結果：CHF患病率為0.9%，按計算約有400萬CHF患者，其中男性為0.7%，女性為1.0%[1]。2011年澳大利亞及新西蘭心臟病學會制定的指南中通過循證醫學證據顯示，高血壓是導致CHF最主要的病因之一[2]。

CHF伴隨的神經內分泌的激活導致血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）含量增多，心肌纖維化則加重心肌重構。根據臨床經驗顯示，鹿芪方可明顯改善CHF患者的心臟功能。本實驗中，筆者通過觀察鹿芪方高、中、低劑量組對腹主動脈縮窄后CHF大鼠血壓、AngⅠ、AngⅡ、ALD、心肌膠原纖維的影響，研究其對CHF大鼠的作用機制，為中醫藥防治心力衰竭提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠54只，購自上海中醫藥大學實驗動物中心。

1.1.2 藥品和儀器 藥品：黃芪、黨參、紅花、葶藶子、桂枝、鹿角粉，按 30∶15∶9∶15∶9∶2 組方，將除鹿角粉以外所有的生藥共5.59 kg加10倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min，過濾，收集濾液。藥渣繼續加8倍量水，煎煮30 min，過濾，收集濾液。濾液合并，濃縮至1∶1，作為常規水提藥液，加入鹿角粉，0.14 kg。以上中藥浸膏均由上海中醫藥大學原創科技提供。培哚普利（片劑），過100目篩后置于雙蒸水，制成37 mg/mL濃度的培哚普利混懸液，由施維雅制藥有限公司提供，批準文號：國藥準字H20034053。大鼠AngⅠ檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），產品批號：H185。大鼠AngⅡ檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），產品批號：H185。大鼠ALD檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），產品批號：H188。電子天平（S artorius公司）；PowerLab8/30生物信號處理和分析系統（Adinstruments公司）；IKA-werkeTyp VX2E震蕩器（IKA公司）；Direct-Q3純水系統（Millipore公司）；Hettich D-78532型高速離心機（德國Hettich公司）；大鼠尾動脈血壓儀BP-3006A型（上海軟隆公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；苦味酸天狼猩紅染液（曙光醫院肝病研究所）。

1.2 方法

1.2.1 高血壓CHF模型的建立 根據Doering等[3]報道的方法行腹主動脈縮窄術：平均體質量為220 g（200～230 g）的SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg體質量）麻醉，仰臥固定后，腹部常規處理,沿膈以下2 cm處切開皮膚和肌肉，打開腹腔找到腹主動脈并分離，將外徑為0.7 mm的穿刺針放于腹主動脈旁，用4號絲線在左腎動脈開口上方約5 mm處將腹主動脈和穿刺針一起結扎，然后將穿刺針抽出，使結扎處動脈處于部分結扎狀態，縮窄程度60%～70%。此種高血壓模型4周后收縮壓＞140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa，下同）為造模成功[4-5]。假手術組不縮窄腹主動脈，余操作同前。各組大鼠于造模成功后灌胃，10周后測量血壓并留取靜脈血，同時開胸留取心肌組織于-80℃冰箱儲存備用。

1.2.2 高血壓合并CHF大鼠分組及給藥方法 動物喂養標準合成飼料，實驗前適應性飼養7 d。造模成功后隨機分組如下：1）模型組。2）假手術組。3）雅施達組。4）鹿芪方高劑量組。5）鹿芪方中劑量組。6）鹿芪方低劑量組。每組大鼠各8只，體質量340～390 g。1）模型組、假手術組：蒸餾水1.0 mL/（kg·d）灌胃；2）雅施達組：雅施達混懸液0.37 mg/（kg·d）灌胃；3）鹿芪方高劑量組：14.56 g/（kg·d）灌胃；4）鹿芪方中劑量組：7.28 g/（kg·d）灌胃；5）鹿芪方低劑量組：3.64 g/（kg·d）灌胃。

1.2.3 血壓測定 參考文獻[6-7]，予3%戊巴比妥鈉1.17 mL/kg腹腔麻醉大鼠，用大鼠尾巴固定裝置固定大鼠左前肢，通過應用尾動脈血壓儀（BP-2006A型）測定血壓和心率。每個動物測5～7次，取其中3個較接近的血壓值平均后作為最終的測量數據。測壓時間固定為上午9：00—11:00。分別于造模前、造模4周后、10周后各測定1次。

1.2.4 血清AngⅠ、AngⅡ、ALD指標測定 從頸總動脈插管處留取血樣本，靜置2 h后以2 500 r/min離心20 min，收集血清。采用生物素雙抗體夾心酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測血清 AngⅠ、AngⅡ、ALD濃度，操作步驟參照試劑盒說明進行。在波長450 nm的酶標儀上讀取各孔吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中大鼠AngⅠ、AngⅡ、ALD濃度。

1.2.5 組織形態學觀察 將所取心臟組織置于10%甲醛溶液中固定，行石蠟包埋，切片、苦味酸天狼星紅染色，光鏡下觀察心臟組織膠原纖維。

1.2.6 統計學處理 用SPSS21.0統計軟件進行數據分析處理，計量資料滿足正態性以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，計量資料呈偏態分布則以M（P25，P75）表示。組間比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

腹主動脈縮窄造模術中共死亡6只大鼠，治療前模型組、假手術組、雅施達組、鹿芪方低劑量組、中劑量組、高劑量組各8只。模型組于造模后CHF死亡1只；雅施達組、鹿芪方中劑量組于治療中各死亡1只，鹿芪方低劑量組于治療中死亡2只。

2.1 鹿芪方對高血壓合并CHF大鼠血壓的影響 造模前，各組在收縮壓和舒張壓方面無統計學差異（P＞0.05）。說明造模前各組基線一致。4周后，假手術組大鼠收縮壓和舒張壓與造模前相比無統計學差異（P＞0.05）。模型組、雅施達組和鹿芪方高、中、低劑量組大鼠收縮壓和舒張壓與造模前相比均有統計學差異（P＜0.01）。其中，假手術組大鼠在收縮壓和舒張壓方面與模型組、雅施達組和鹿芪方高、中、低劑量組相比均有統計學差異（P＜0.01），說明造模成功。見表1。

表1 造模前與造模4周后大鼠收縮壓、舒張壓的變化（x±s）Tab.1 Thechangesof systolic pressureand diastolic pressurein ratsbeforeand after modeling for 4 weeks（x±s）

高血壓后CHF組大鼠予鹿芪方高、中、低劑量干預8周，與模型組相比，鹿芪方各組及雅施達組均能有效降低CHF大鼠的收縮壓（P＜0.05）。在降低收縮壓方面，鹿芪方高劑量與中劑量差異無統計學意義（P＞0.05），但優于低劑量（P＜0.05），提示隨劑量增加，鹿芪方降低收縮壓的效能有所增強。在舒張壓方面，雅施達組與模型組相比能降低舒張壓（P＜0.05），鹿芪方各劑量組與模型組相比雖無統計學意義（P＞0.05），但鹿芪方各劑量組優于模型組。鹿芪方各劑量組與雅施達組相比無統計學意義（P＞0.05）。見表 2。

表2 治療后高血壓合并CHF大鼠血壓的變化（x±s）Tab.2 Thechangesof blood pressurein hypertensiverats with heart failureafter treatment（x±s）

2.2 鹿芪方對高血壓合并CHF大鼠AngⅠ、AngⅡ、ALD的影響 與模型組相比，鹿芪方高、中、低劑量組及雅施達組均能有效降低AngⅠ、AngⅡ及AL D（P＜0.05）。其中，在改善AngⅠ方面，鹿芪方各組之間、鹿芪方與雅施達組之間未顯示出差異（P＞0.05）。在改善AngⅡ方面，鹿芪方各組之間未顯示出差異（P＞0.05），各組療效均不及雅施達組（P＜0.05）。在改善ALD方面，鹿芪方高劑量組明顯優于低劑量組（P＜0.01），與鹿芪方中劑量組無差異（P＞0.05），與雅施達組相比無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 鹿芪方對高血壓合并CHF大鼠心肌膠原纖維的觀察 苦味酸-天狼星紅染色：鏡下觀察，膠原纖維呈紅色，其他部分呈淡黃色，假手術組大鼠心肌膠原纖維分布均勻、排列整齊、集合成束。模型組心肌膠原纖維明顯增多，分布不均，排列紊亂，粗大的膠原纖維互相交錯成網狀。與假手術相比，鹿芪方高、中、低劑量、雅施達組均可見心肌膠原纖維數量增多，排列紊亂，但程度均較模型組減輕，其中鹿芪方高劑量組、雅施達組程度最輕。見圖1。

模型組：心肌膠原纖維明顯增多，分布不均，排列紊亂，粗大的膠原纖維互相交錯成網狀。假手術組：心肌膠原纖維分布均勻、排列整齊、集合成束。雅施達組：心肌膠原纖維稍增多，排列略紊亂，膠原纖維集合成束。鹿芪方高劑量組：心肌膠原纖維稍增多，排列略紊亂，膠原纖維集合成束。鹿芪方中劑量組：心肌膠原纖維增多，排列較紊亂，膠原纖維少量互相交錯成網狀。鹿芪方低劑量組：心肌膠原纖維增多，排列紊亂，部分膠原纖維互相交錯成網狀。

3 討論

CHF涉及到中醫的心痹、心悸、飲證、喘證、水腫等病證范疇。在CHF晚期，主要表現為心腎陽虛。有臨床及實驗研究已證實[8-9]在治療CHF上應強調心腎相交，心本乎腎，以溫腎求強心。所謂“治心之所以治腎，而治腎之所以治心”。心之陽氣全賴腎陽的資助。腎陽虛可波及于心，引起心陽虛。本病為本虛標實，而本虛以氣虛、陽虛為主。病位雖主要在心，但與腎的關系尤為密切[10]。本方來源于周華教授臨床治療慢性CHF經驗方鹿芪方，通過溫補腎陽，溫腎益氣使心陽得到溫煦；通過活血利水，使心血瘀阻得通，水液潴留得利。在鹿芪方中，鹿角味咸，性溫，乃血肉有情之品。《要藥分劑》曰：“入腎經，兼入心、肝二經。”具有補腎壯陽、補益精血，使腎氣有根，上通于心，心氣亦足。上海曙光醫院長久以來通過研究鹿角系列制劑的臨床及科研作用機制發現，以鹿角為君藥的制劑能顯著改善患者及大鼠的心功能，增強心肌收縮力，使冠狀動脈的血流得以改善；還能改善心肌重構，調節心肌能量代謝，延緩CHF的進程[11-12]。紅花與鹿角共奏溫通心脈，溫陽活血之功。桂枝與黃芪、黨參合用，既助君藥溫陽通脈，又具有強大的益氣功效。葶藶子能瀉肺降氣，祛痰平喘，利水消腫。

表3 治療后高血壓合并CHF大鼠AngⅠ、AngⅡ和ALD的變化M（P25，P75）Tab.3 The changesof AngⅠ，AngⅡ and aldosteronein hypertensive ratswith heart failure after treatment M（P25，P75）

圖1 苦味酸-天狼星紅染色Fig.1 Picrosiriusred staining

高血壓以體循環動脈壓升高為主，長期高血壓會導致左室壓力負荷增加，心肌肥厚和重塑，進而出現CHF。本實驗發現，鹿芪方各組及雅施達組均能有效降低CHF大鼠的收縮壓，鹿芪方高劑量組與中劑量組均優于低劑量組，提示隨劑量增加，鹿芪方降低收縮壓的療效有所提高。在降低舒張壓方面，鹿芪方各劑量組與模型組相比雖無統計學意義，但鹿芪方各劑量組均優于模型組。

CHF是一個漸進性疾病，其嚴重之處在于病理過程的不可逆性，而心室重構是其重要機制。腎素-血管緊張素-醛固酮系統（RAAS）激活被認為是CHF發生發展最核心的機制。血管緊張素包括AngⅠ和AngⅡ，AngⅡ分泌增加可促進心肌纖維化，與心室重構和心功能損傷密切相關[13]。王振濤等[14]對CHF模型大鼠的研究發現，降低AngⅡ活性可抑制其內分泌和旁分泌，從而改善心功能。醛固酮（ALD）可引起水鈉潴留，促進成纖維細胞合成膠原纖維，最終導致心室重構[15]。因此，通過調控RAAS相關因子可有效干預心室重構。本實驗中，鹿芪方各劑量組和雅施達組大鼠AngⅠ、AngⅡ、ALD含量明顯低于模型組，可見鹿芪方在一定程度上能抑制RAAS系統，改善心室重構，總體而言鹿芪方高劑量組療效較中、低劑量組顯著。

心肌纖維化在CHF后期的發生發展中起著重要的作用，包括成纖維細胞的增多和細胞外基質的增加。心臟膠原纖維是典型的心肌纖維化標志物[16]。通過對大鼠心肌苦味酸-天狼星紅染色的觀察發現，鹿芪方各劑量組和雅施達組的膠原含量明顯低于模型組。鹿芪方高劑量組要優于中、低劑量組。由此可見，鹿芪方能抑制膠原的增生，改善心肌纖維化，抑制心室重構，從而延緩CHF的進程。此療效呈劑量依賴性。

綜上所述，鹿芪方在降低血壓、改善CHF心肌受損方面有一定的療效，能抑制RAAS系統活性，延緩高血壓合并CHF大鼠的心肌重構從而延緩CHF的進程。因此，鹿芪方在CHF的進展過程中能起到一定的防治作用，其前景廣闊。

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