四逆散對心理應激肝郁證模型大鼠ERK1/2-CREB信號通路的影響*

王瑞婷 ，王雅楠 ，，宋殿榮 ，孟文曼 ，郭 潔 ，姜 晶 ，張繼雯 ，許春月

心理應激是指機體在某種環境刺激作用下由于客觀要求和應對能力不平衡所產生的一種適應環境的緊張反應狀態[1]。刺激過強、時間過長的不良應激可導致神經-內分泌-免疫調節功能紊亂。手術作為一種應激源，可導致患者一系列不良應激反應發生。課題組前期對1 283例因婦科良性腫瘤擇期手術患者臨床調查發現，婦科術前患者中不良心理應激反應的發生率為64.15%，其中62.21%為肝氣郁結證[2]，四逆散可調節術前不良心理應激激素和神經遞質的紊亂[3]。為進一步探討四逆散改善心理應激肝郁證的作用及其機制，本研究采用慢性束縛制動結合孤養的方法制備心理應激肝郁證大鼠模型，通過觀察四逆散對大鼠血漿和腦脊液應激相關激素、神經遞質及海馬和下丘腦部位細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）1/2-cAMP反應元件結合蛋白（CREB）信號通路關鍵分子及c-fos mRNA和蛋白質表達的影響，試圖闡明四逆散通過ERK1/2-CREB信號通路改善心理應激肝郁證的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性SD大鼠，級別SPF/VAF，體質量（190～210）g，由軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所提供，許可證號為SCX K（軍）2014-0001。

1.2 藥物 四逆散顆粒劑（柴胡、白芍、枳實、炙甘草各10 g，北京康仁堂藥業有限公司），艾司唑侖（1 mg/片，山東信誼制藥有限公司）。

1.3 主要試劑 半定量PCR試劑盒和山羊抗兔IgG（H＋L）二抗（Promega公司）。絲裂原活性蛋白激酶激酶 1/2（MEK1/2）、ERK1/2、CREB、c-fos 及內參GAPDH的特異性引物（由上海生工生物工程股份有限公司設計與合成），兔抗鼠p-MEK1/2一抗（abcam公司），兔抗鼠p-ERK1/2一抗、兔抗鼠p-CREB一抗、兔抗鼠c-fos一抗、兔抗鼠GAPDH一抗（Millipore公司），促腎上腺皮質激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質激素（ACTH）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海藍基生物科技有限公司）。

1.4 主要儀器 高架十字迷宮及分析系統（SLY-ETS型），北京碩林苑科技有限公司；自制大鼠束縛筒；全自動多功能酶標儀（GF-M3000型），山東高密彩虹分析儀器有限公司；PCR擴增儀（PCRSystem9700），Gene Amp公司；水平電泳儀（cavoy）；垂直電泳儀、轉膜儀（DYCZ-24DN型）；BIO-RAD凝膠成像系統（YQ-602BR1104型），美國伯樂公司。

1.5 方法

1.5.1 心理應激肝郁證模型的建立及分組 將120只大鼠正常飼養、自由飲食、適應性飼養1周后，隨機分為正常對照組、模型空白組、四逆散組、艾司唑侖組各30只。應用慢性束縛制動結合孤養的方法制備心理應激肝郁證大鼠模型[4]：將大鼠依次放入自制的束縛筒內（筒長約20 cm，筒口內徑最寬處5.5 cm，最窄處2.2 cm），通過移動閘門而逐步縮小大鼠的活動空間，調節到其不產生強烈反抗的緊張程度，每日束縛制動1次，持續時間由第1天3 h，以后每次增加30 min，連續21 d。造模大鼠在束縛制動期間禁食、禁水，其余時間放出，自由飲食。正常對照組不予任何干預，自由飲食，每籠5只。根據造模前后大鼠一般狀態、體質量增長情況、高架十字迷宮實驗驗證心理應激肝郁證模型成功。

1.5.2 給藥 大鼠給藥劑量按人與動物體表面積折算[5]，給藥劑量=臨床常用量×動物等效劑量系數（大鼠與人的等效劑量系數為0.018），灌胃容積10 mL/kg。四逆散組給予四逆散混懸液3.6 g/（kg·d）灌胃，艾司唑侖組給予艾司唑侖溶液0.36 mg/（kg·d）灌胃，模型空白組給予生理鹽水灌胃，均自造模結束后第3天開始灌胃，2 mL/次，每日1次，連續5 d，正常對照組不予任何干預。

1.5.3 取材 于末次給藥24 h后處死大鼠。取各組10只大鼠，股動脈采血 3 mL，4℃，3 000 r/min，離心15 min，取血漿，-20℃保存備用。取各組10只大鼠，枕骨大孔直接穿刺法取腦脊液100～200μL，-20℃保存備用。取各組10只大鼠，經0.1 mol PBS心臟灌注后取全腦，迅速分離出海馬及下丘腦組織放入凍存管中，放入液氮中速凍后，-80℃保存備用。

1.5.4 ELISA法檢測血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE和5-HT的含量 采用ELISA法測定大鼠血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE和5-HT含量。

1.5.5 半定量PCR法檢測海馬和下丘腦MEK1/2、ERK1/2、CREB及c-fosmRNA的表達 RNeasy Plus Mini試劑盒一步法分別提取各組大鼠海馬和下丘腦組織總RNA，采用紫外分光光度儀測總RNA的濃度、純度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，以提取的總RNA為模板，反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增，PCR擴增后的產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描拍攝系統掃描后，運用Image J圖像分析系統測定光密度值，目的基因與內參條帶光密度值的比值作為結果進行統計分析。PCR反應體系：GoTap Green Master Mix2X 12.5μL，上游引物 10μmol/L 2μL，下游引物10μmol/L 2μL，cDNA模板4μL，無核酸酶水補至終體積25μL。PCR擴增條件：預變性（94℃4min），變性（94℃45 s），退火（56℃45 s），延伸（72℃ 45 s），30個循環。引物序列見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence table

1.5.6 Western blot法檢測海馬和下丘腦部位p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 及 c-fos蛋白的表達 提取各組大鼠海馬和下丘腦組織總蛋白，BCA法進行蛋白定量。各取50μg蛋白，按照4∶1體積加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，蛋白變性后，進行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結束后，根據蛋白分子大小進行切膠，濕轉至PVDF膜，p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB及內參 GAPDH蛋白分別用Western封閉液室溫封閉90 min后，分別加入一抗（兔抗鼠p-MEK1/2抗體、p-ERK1/2抗體、p-CREB抗體、GAPDH抗體按1∶1 000稀釋，兔抗鼠c-fos抗體按 1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜，Western洗滌液洗膜5次，10 min/次。加入二抗（山羊抗兔IgG（H＋L）按 1∶5 000 稀釋），室溫水平搖床孵育 60 min，Western洗滌液洗膜5次，10 min/次。經過ECL曝光顯色，BIO-RAD凝膠成像系統攝像掃描后，運用Image J圖像分析系統測定條帶灰度值，采用目的蛋白與內參條帶灰度值的比值作為結果進行統計分析。

1.6 統計學方法 運用SPSS 23.0統計軟件分析，結果以均值±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心理應激肝郁證模型的建立

2.1.1 大鼠體質量增長情況 與正常對照組比較，造模組大鼠體質量增長緩慢，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 兩組大鼠體質量增加量（與造模前體質量的差值，x±s）Tab.2 Body weight of rats（the difference before modeling,x±s）g

2.1.2 大鼠一般狀態的變化 正常對照組和造模組大鼠造模前一般狀態均正常：精神狀態良好，反應活躍，情緒狀態正常，皮毛光順潤澤，飲食睡眠正常，糞便呈球形或橄欖球形，干稀適中。造模結束后，正常對照組一般狀態正常，造模組精神倦怠，反應遲緩，情緒低落，皮毛枯槁，飲食減少，嗜睡，大便稀溏。

2.1.3 大鼠高架十字迷宮實驗 正常對照組大鼠造模前后高架十字迷宮實驗結果差異無統計學意義（P＞0.05）。造模組大鼠，與造模前比較，造模后進入開放臂次數百分比（OE%）及時間百分比（OT%）均明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。造模后進入閉合臂次數百分比（CE%）和閉合臂時間百分比（CT%）明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組大鼠造模前后高架十字迷宮實驗結果（x±s）Tab.3 Resultsof thedesign of theelevated crosslabyrinth experiment beforeand after modeling(x±s)%

2.2 各組大鼠血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE和5-HT的含量 與正常對照組比較，模型空白組血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE水平明顯升高，5-HT的水平明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。與模型空白組比較，四逆散組和艾司唑侖組均能明顯降低血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE的水平，升高5-HT的水平，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表4、表5。

2.3 各組大鼠海馬及下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB及c-fos mRNA的表達 與正常對照組比較，模型空白組大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREBmRNA 的表達明顯減少（P＜0.05）。與模型空白組比較，四逆散組和艾司唑侖組大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB mRNA 的表達明顯增加（P＜0.05）。各組大鼠間海馬和下丘腦部位c-fosmRNA的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 6、圖 1。

2.4 各組大鼠海馬和下丘腦部位p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB及c-fos蛋白的表達 與正常對照組比較，模型空白組大鼠海馬和下丘腦部位p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 蛋白的表達明顯減少，差異具有統計學意義（P＜0.05）。與模型空白組比較，四逆散組和艾司唑侖組大鼠海馬和下丘腦部位p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 蛋白的表達明顯增加，差異具有統計學意義（P＜0.05）。各組大鼠間海馬和下丘腦部位c-fos蛋白的表達差異無統計學意義（P＞0.05）。見表 7、圖 2。

表4 各組大鼠血漿E、NE、CRH、ACTH和5-HT的含量(x±s)Tab.4 Levels of CRH,ACTH,E,NE and 5-HT in plasma(x±s)pg/mL

3 討論

肝郁證與現代心理應激密切相關，均屬于情志致病的范疇，且都表現出神經-內分泌-免疫網絡調節(NIM)功能的紊亂，疏肝方藥可通過調節心理應激相關激素及神經遞質的水平改善肝郁證的作用[6-7]。肝主疏泄，能夠調節氣機、調暢情志、調和氣血，是臟腑組織器官的調節中心。四逆散首載于《傷寒論》，由柴胡、白芍、枳實、炙甘草組成，具有疏肝理脾、透邪解郁、調和胃氣的作用。課題組前期通過臨床研究發現四逆散能夠降低術前心理應激肝郁證患者的 CRH、ACTH、COR、E、NE、白介素-2（IL-2）含量，升高多巴胺（DA）、5-HT的含量，明顯改善術前心理應激肝郁證患者的心理和軀體癥狀[3]。

表5 各組大鼠腦脊液E、NE、CRH、ACTH和5-HT的含量(x±s)Tab.5 Levelsof E,NE,CRH,ACTH and 5-HT in cerebrospinal fluid(x±s)pg/mL

表6 各組大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB及c-fosmRNA的表達(x±s)Tab.6 Expression of MEK1/2,ERK1/2,CREB and c-fos mRNA in the hippocampusand hypothalamus(x±s)

圖1 各組大鼠海馬和下丘腦MEK1/2、ERK1/2、CREB及c-fosmRNA的表達Fig.1 Expression of MEK1/2,ERK1/2,CREB and c-fos mRNA in the hippocampus and hypothalamus

表7 各組大鼠海馬和下丘腦p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB及c-fos蛋白的表達(x±s)Tab.7 Expression of p-MEK1/2,p-ERK1/2,p-CREB and c-fos protein in the hippocampusand hypothalamus(x±s)

圖2 各組大鼠海馬和下丘腦p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB及c-fos蛋白的表達Fig.2 Expression of p-MEK1/2,p-ERK1/2,p-CREB and c-fos protein in the hippocampusand hypothalamus

本研究采用慢性束縛制動結合孤養的方法制備心理應激肝郁證大鼠模型，研究發現，心理應激刺激可升高大鼠血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE水平，降低5-HT的水平。四逆散及艾司唑侖均能降低模型大鼠血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE的水平，升高5-HT的水平，改善模型大鼠肝郁狀態。

下丘腦為神經內分泌系統的中心，海馬富含各種信使受體，其中糖皮質激素受體（GR）與HPA軸功能亢進釋放的大量糖皮質激素結合，導致海馬GR減少，海馬神經元損傷，對HPA軸的負反饋調節作用減弱，使HPA軸處于持續亢進狀態[8]。因此抑制海馬和下丘腦神經元應激性損傷，恢復海馬和下丘腦功能是調節神經內分泌平衡，調節情志的方法之一。ERK是一種蛋白酶細胞內信號分子，C REB是一種調節基因轉錄的蛋白質，CREB可通過ERK信號通路的磷酸化級聯反應激活，參與調節神經元細胞存活、增殖、凋亡、修復的過程[9]。細胞受到刺激后通過連續的磷酸化級聯反應（Ras/Raf/MEK/ERK）激活ERK1/2，活化的ERK1/2放大信號并將信號從細胞膜傳導到細胞核中，使細胞核中的CREB蛋白磷酸化，p-CREB結合于DNA的特定部位并調節多種基因的轉錄。CREB可通過CREB蛋白與c-fos基因啟動子區的cAMP反應元件（CRE）位點結合，對c-fos基因的表達進行調控[10]，與腦源性神經營養因子（BD NF）基因啟動子區CRE位點結合，對BDNF基因的表達進行調控[11]。大量研究表明ERK/CREB信號通路在心理應激性疾病的發病機制中發揮重要作用，心理應激狀態下，ERK/CREB信號通路受到抑制，ERK、CREB的磷酸化水平下調，而不同的抗抑郁治療可通過上調ERK、CREB磷酸化水平達到抗抑郁的作用[12-13]。本研究發現心理應激大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB mRNA及p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 蛋白的表達明顯降低，四逆散和艾司唑侖均能夠上調肝郁證大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB mRNA及p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 蛋白的表達，從而改善模型大鼠肝郁狀態。

c-fos是參與細胞最早功能活動的基因，在細胞受到外部刺激后最先表達，被作為神經元活動的標志。在生理狀態下c-fos基因在細胞內包括神經元中呈較低水平表達，當受到刺激時，可誘導中樞神經系統（CNS）中c-fos基因快速、急劇、靈敏的表達[14]。促皮質激素釋放激素（CRF）是c-fos的下游靶基因，應激發生時下丘腦首先被激活，下丘腦室旁核部位的c-fos作為第三信使調節CRF的表達，啟動HPA軸，進而影響與應激有關的神經內分泌免疫活動[15]。而c-fos基因的表達具有時效性，目前對慢性應激刺激時c-fos表達的研究觀點不一，Matsuda等[16]研究顯示慢性應激可以誘導c-fos持續表達。劉昊等[17]研究發現，慢性應激結束后0.5h c-fos蛋白及mRNA的表達明顯升高，之后呈下降趨勢，4 h時恢復正常。宋倩[18]則研究發現，慢性應激減少了小鼠海馬區、前腦皮層及下丘腦室旁核c-fos的表達。本研究結果顯示，各組大鼠海馬和下丘腦部位c-fos的表達無明顯變化。

綜上所述，四逆散改善心理應激肝郁證，可能與降低血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE的水平，升高5-HT水平有關，其機制可能與上調ERK1/2-CREB信號通路的活動有關，可能通過激活此信號通路磷酸化過程促進神經元應激性損傷的修復而發揮抗肝郁作用。

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