蚓激酶的提取工藝改進研究*

涂清波，蘇鵬亮，林 穎，陸冬鶯，王賽男，馬宇凡，徐 丹

蚓激酶又稱蚯蚓纖溶酶，1983年由Mihara等[1]首次從蚯蚓中提取分離出來。2010版藥典標準定義為：系人工養殖的赤子愛勝蚓中提取制備的一組蛋白水解酶。分子量20～40 KD、等電點3～5，在60℃以下非常穩定，最適活性在pH7～9。兼有激酶和纖溶酶兩種作用，可直接水解纖維蛋白和凝血因子Ⅰ，選擇性激活血塊纖溶酶原，抑制血栓素等，為第三代溶栓藥，具有溶栓作用強、不良反應小、患者易耐受、半衰期長等特點[2-5]。目前制備蚓激酶的方法主要是從新鮮蚯蚓中經硫酸胺沉淀法粗分離和葡聚糖凝膠-離子交換層析法的純化得到蚓激酶，缺點是在生產上使用大量的硫酸胺，后處理除鹽非常困難，工業除鹽的主要方法為透析層析等，導致操作工藝復雜、周期延長、活性下降[6-9]。本文以蚓激酶活性為指標對提取工藝進行改進。

1 材料

1.1 儀器 2-16型冷凍離心機（Sigma公司）；分部收集器（上海滬西分析儀器廠）；DS-1高速組織搗碎機（上海右一儀器有限公司）；冷凍干燥機（上海豫明儀器有限公司）；電子分析天平和pH計（梅特勒托利多儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑 赤子愛勝蚓（匯豐蚯蚓養殖基地）；Sephadex G-75和DEAE-Sepharose FF（上海安妍生物有限公司）；蚓激酶，凝血酶和牛血纖維蛋白原對照品（中檢所）；其他常用試劑為國產分析純。

2 方法與結果

2.1 酶活測定

2.1.1 標準品溶液的制備 取蚓激酶標準品，加0.9%氯化鈉溶液制成濃度分別為1 mL中含10 000、8 000、6 000、4 000、2 000 單位的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取供試品適量，加0.9%氯化鈉溶液稀釋成標準曲線范圍內的濃度。測定法：將已加熱的瓊脂糖溶液39 mL，纖維蛋白原溶液39 mL和凝血酶3 mL，混勻，倒入直徑14 cm的培養皿中，室溫放置1 h，打孔進樣。每孔加樣品10μL，于37℃恒溫放置18 h。測量溶圈的面積。以蚓激酶標準品單位數的對數為橫坐標，蚓激酶標準品溶圈兩垂直直徑乘積的對數為縱坐標，計算標準曲線回歸方程。將供試品溶圈兩垂直直徑乘積的對數代入回歸方程Y=1.211X+1.566（R2=0.995），計算供試品效價單位數[10]。

2.1.3 蛋白含量 取本品約20 mg，精密稱定，照氮測定法，將結果乘以6.25，即為供試品中蛋白含量，并計算每1 mg供試品中的蛋白毫克數。比活力=每1 mg供試品中效價單位數/每1 mg供試品中蛋白的毫克數

2.2 提取方法的選擇 蚓激酶主要提取方法有[7-9]：生理鹽水提取法，蔗糖溶液提取法，乙醇提取法和緩沖液提取法。本實驗以酶活為指標對此4種方法進行考察。提取流程為：取20 g經洗凈泥土和清水浸泡2 h的新鮮蚯蚓，勻漿，常溫下加2倍量不同提取溶劑（0.9%氯化鈉溶液，10%蔗糖溶液，75%乙醇溶液，pH 7.8磷酸緩沖溶液）勻漿20 min后，10000 r/min低溫離心，上層清液過透析袋（35 KD）透析，得到蚓激酶母液，檢測酶活。由表1可知，緩沖液提取法提取蚓激酶活性較佳。

表1 蚓激酶的提取Tab.1 Extraction of lumbrokinas μ/mg

2.3 粗分離方法的選擇 蚓激酶粗分離的主要方法有[9-10]：熱沉淀法，乙醇沉淀法，丙酮沉淀法和硫酸胺沉淀法。以酶活為指標對此4種方法進行考察。

2.3.1 熱沉淀法 將蚓激酶母液在60℃保溫1 h，離心，上清液冷凍干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.2 硫酸胺沉淀法 將蚓激酶母液加硫酸胺調至飽和度70%，放冰箱冷藏過夜，離心，沉淀物透析除鹽，冷凍干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.3 丙酮沉淀法 將蚓激酶母液加入一定量冷丙酮析出，放冰箱冷藏過夜，離心，沉淀物冷凍干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.4 乙醇沉淀法 將蚓激酶母液加入一定量冷乙醇析出，放冰箱冷藏過夜，離心，沉淀物冷凍干燥得到蚓激酶粗酶。

由表2可知，硫酸胺沉淀法，丙酮沉淀法和乙醇沉淀法粗分離效果較佳，但硫酸胺法需要透析除鹽，時間周期長；丙酮為低閃點溶劑，不適合工業化生產；乙醇為第3類溶劑且成本低易回收，故選用乙醇沉淀法。

2.4 乙醇沉淀法的改進 乙醇沉淀法是根據乙醇使蚓激酶母液的介電常數降低，增加了兩個相反電荷基團之間的吸引力，促使酶析出，酶活主要影響因素為乙醇含量。

2.4.1 乙醇含量因素考察 按照乙醇沉淀法，考察乙醇含量為30%、45%、60%、75%、90%對酶活的影響。由表3可知，蚓激酶的活性隨乙醇含量增大而提高，說明乙醇含量越大蚓激酶析出越多。低乙醇含量時活性小于母液，說明低乙醇含量時雜蛋白析出較多。在45%～60%時上升坡度最大，75%～90%時趨于最大點，說明45%時析出雜蛋白最多，75%時析出蚓激酶最多。

表2 蚓激酶的粗分離Tab.2 Coarseseparation of lumbrokinas μ/mg

表3 乙醇沉淀法中乙醇含量的影響Tab.3 Effect of alcohol precipitation on wineaccuracy μ/mg

2.4.2 乙醇分級沉淀法 將乙醇投入蚓激酶母液中，控制乙醇含量為45%，冷藏過夜后離心，取上清液用乙醇繼續調節乙醇含量75%，冷藏過夜后離心，沉淀物冷凍干燥得到蚓激酶粗酶，酶活為7 438μ/mg，優于改進前乙醇沉淀法及其他3種分離方法。

2.5 粗酶純化方法的改進 蚓激酶的純化工藝主要是先后經葡聚糖凝膠層析和離子交換層析和親和層析等，層析柱用的最多的是Sephadex G-25，Sephadex G-75 和 DEAE-Cellucose-52，DEAESepharose FF。

2.5.1 純化方法的選擇 將粗酶用pH7.8磷酸緩沖液溶解，過葡聚糖凝膠柱（16 mm×960 mm），緩沖液淋洗，活性組分的洗脫液再過離子交換層析柱（16 mm×200 mm），先用0.1 mol/L的食鹽水淋洗，再用0.1～0.6 mol/L食鹽水進行梯度洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得到蚓激酶。如表4所示，Sephadex G-75與DEAE-Sepharose FF層析方法的純化效果較好。

表4 粗酶的純化Tab.4 Purification of crude enzyme μ/mg

2.5.2 純化工藝的改進 調換層析工序，將凝膠層析放到離子交換層析的后面進行。流程為將粗酶用pH7.8磷酸緩沖液溶解，過DEAE-Sepharose FF（16 mm×200 mm），先用0.1 mol/L的食鹽水淋洗，再用0.1～0.6 mol/L食鹽水進行梯度洗脫，活性組分的洗脫液再過 Sephadex G-75（16 mm×960 mm），用清水洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得到蚓激酶，酶活為 28 000μ/mg。

3 討論

以赤子愛勝蚓為原料，采用的緩沖液提取、乙醇分級沉淀、離子交換層析、葡聚糖凝膠層析、干燥等工序，制得蚓激酶比活為28 000μ/mg，優于舊工藝。

乙醇分級沉淀法是根據不同濃度的乙醇具有析出不同蛋白質的原理，從分離后蚓激酶的活性來看，進一步說明了低濃度乙醇會析出大量雜質，高濃度則析出蚓激酶。本文經單因素實驗粗略選取了乙醇含量為45%作為析出雜質最優點和乙醇含量為75%作為析出蚓激酶最優點，未考察交叉因素的影響，經優化實驗設計可進一步得出最佳工藝。

蚓激酶的分子量為20～40 KD，Sephadex G-75和DEAE-Sepharose FF的分離范圍為3～80 KD，從結果上可以看出，純化Sephadex G-25和DEAECellucose-52對蚓激酶的純化。凝膠層析具有脫鹽純化的作用，將Sephadex G-75放到最后有利于酶的純化。

目前工業生產蚓激酶的方法主要參照權利專利CN102242099B，經提取、超濾、硫酸胺沉淀、Sephadex G-25和DEAE-Cellucose-52分離制備，本法無需鹽析、超濾、透析等繁瑣而長周期工序，簡化了操作步驟，適合工業化生產。

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