SHIP2在放射線處理后喉癌Hep—2細胞中的增殖、凋亡及細胞周期中作用

梁慧玲+何曉琴+甘園園

[摘要] 目的 研究放療后SHIP2在喉癌Hep-2細胞中的表達情況及與Hep-2細胞增殖、凋亡及細胞周期之間的對應關系。 方法 取對數生長期的喉癌Hep-2細胞，分為實驗組（2、4、8 Gy X線）與對照組（0 Gy X線）兩組，各組給予不同劑量X線處理后12、24、36、48 h，運用CCK-8檢測Hep-2細胞增殖活力。根據細胞活力檢測結果，確定射線處理后最適宜的時間點作為后續(xù)實驗檢測的具體時間點。實驗組與對照組給予對應處理后特定時間，運用Annexin V-FITC/PI雙染流氏細胞術檢測細胞凋亡，PI單染流式細胞術檢測細胞周期，RT-qPCR檢測SHIP2 mRNA相對表達量，Western-blot檢測SHIP2蛋白的相對表達量。 結果 與對照組比較，實驗組Hep-2細胞活性降低（P < 0.05），且隨放射劑量遞增，細胞增殖活力降低，處理后48 h檢測結果最為顯著。實驗組各組Hep-2細胞凋亡數較對照組均明顯增加（均P < 0.01）。實驗組中給予4 Gy、8 Gy X線照射處理的Hep-2細胞G2/M期阻滯與對照組相比顯著增加（均P < 0.01）。實驗組Hep-2細胞中SHIP2的mRNA及蛋白相對表達量較對照組均有所降低（均P < 0.01）。 結論 放射線處理后SHIP2的下調表達可能是X線抑制Hep-2細胞增殖、促進其細胞凋亡和G2/M期阻滯的重要途徑。

[關鍵詞] X線；SHIP2；增殖；凋亡；細胞周期

[中圖分類號] R739.65 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0004-06

[Abstract] Objective To explore the relation between the expression of SHIP2 and proliferation， apoptosis and cell cycle in Hep-2 cells after radiotherapy. Methods Lupine carcinoma Hep-2 cells were divided into the experiment group （treated with 2， 4， 8 Gy X- ray） and the control group （treated with 0 Gy）. CCK-8 was repeatedly used to detect the proliferation of the cells 12， 24， 36 h and 48 h after the treatment. The most appropriate and exact time to detect cells in the subsequent experiment was set up following the result of proliferation. Then apoptosis was evaluated by AnnexinV- FITC/PI double staining flow cytometry and cell cycle was evaluated by PI single staining flow cytometry. RT-qPCR and Western-blot were used to detect the expression of SHIP2 mRNA and its protein. Results Compared with the control group， Hep-2 cells' proliferation in the experiment group was inhibited （all P < 0.05） . As the dose of ray increased， the viability descended， and the most remarkable result arose 48 h after the treatment. There was a remarkable increase in apoptosis of the experiment group （all P < 0.01）. After treated with 4 Gy and 8 Gy X-ray G2/M phase arrest was remarkable too （all P < 0.01）. The expression of SHIP2 mRNA and SHIP2 protein in the experiment group was lower than those of the control group （all P < 0.01）. Conclusion In Hep-2 cells， low expression of SHIP2 after the treatment with X-ray， may be one important pathway of X-ray inhibiting cell proliferation and increasing cell apoptosis and G2/M phase arrest.

[Key words] X-ray； SHIP2； Proliferation； Apoptosis； Cell cycle

喉癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一，其最常見的病理類型為鱗狀細胞癌[1-2]。手術和放射治療是喉癌的主流治療方式，在保留喉部功能從而保證治療后生活質量方面放療明顯優(yōu)于手術治療，但由于喉癌細胞內在的放射敏感性不同，甚至部分喉癌細胞出現輻射耐受的情況，使得部分患者的放射治療效果并不理想[3]。為了探明喉癌細胞的輻射耐受機制，人們做了各種各樣的嘗試。有研究發(fā)現，放射后腫瘤細胞的某些基因表型發(fā)生改變，并且認為這種改變與腫瘤細胞的輻射耐受存在相關性[4-5]。含SH2域的多磷酸肌醇-5-磷酸酶Ⅱ（the SH2 domain containing inositol polyphosphate 5-phosphatase-2，SHIP2）作為一種重要的多磷酸肌醇-5-磷酸酶，在多種惡性腫瘤中表達下降，成為各類型腫瘤研究的熱點[6]，Ye等[7]提出SHIP2在胃癌中的表達下調，進而提高了胃癌細胞的PI3K/Akt信號通路的活性、促進了腫瘤細胞的增殖和生長，Bao等[8]提出，PI3K/Akt信號通路活性的增強可能使喉癌細胞產生輻射耐受。因此，本研究認為SHIP2可能參與喉癌細胞的增殖與生長，并可能與喉癌的輻射耐受存在相關性。endprint

鑒于以上原因，本研究設計了以下實驗：研究分析人鱗狀細胞癌株Hep-2細胞X線照射后細胞增殖、凋亡和周期的變化以及細胞中SHIP2的表達情況，從而證實SHIP2是否與喉癌細胞的增殖、生長有關，為臨床上研究喉癌患者放射敏感性的個體化及預測其預后提供新途徑。

1 材料與方法

1.1 細胞株及培養(yǎng)條件

人鱗狀細胞癌株Hep-2細胞購于武漢大學細胞典藏中心。細胞培養(yǎng)條件：含10%胎牛血清的DEME培養(yǎng)基，37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑 DEME高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自美國Hyclone公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液、PBS緩沖液購自GIBCO公司；胎牛血清購自杭州四季青公司；羊抗SHIP2抗體購自Santa Cruz公司；小鼠抗β-actin抗體、辣根過氧化物（HRP）標記的兔抗羊抗體購自武漢博士德生物公司；RNA提取試劑TRIzol及二甲基亞砜（DMSO）購自Invitrogen公司；RNA逆轉錄試劑盒、PCR反應試劑盒、細胞增殖活性檢測試劑盒CCK-8均購自江蘇碧云天公司；細胞凋亡檢測試劑盒Annexin V-FITC/PI apoptosis kit及細胞周期染色試劑盒cell cycle stain kit均購自杭州聯科科技有限公司；十二烷基磺酸鈉聚丙酰胺（SDS-PAGE）凝膠制備試劑盒、RIPA總蛋白裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、ECL化學發(fā)光檢測試劑盒、蛋白酶抑制劑混合物均購自ASPEN公司。

1.2.2 主要儀器 倒置顯微鏡：BX51，日本Olympus公司；超凈工作臺：AIRTECH公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱：CB150，德國Binder公司；酶標儀：美國PerkinElmer公司；熒光定量PCR儀：7500，美國ABI公司；凝膠成像系統(tǒng)：Geliance 200，美國PerkinElmer公司；穩(wěn)壓穩(wěn)流蛋白電泳儀：MINI，美國BIO-RAD公司；Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)：LI-COR Odyssey公司；流式細胞儀：美國BD公司；紫外分光光度計：UV762，上海精密科學儀器有限公司。

1.3照射條件

指數生長期的Hep-2細胞，6 MV X線0、2、4、8 Gy照射，射野30 cm×40 cm，SSD = 100 cm，培養(yǎng)瓶上覆蓋0.5 cm有機玻璃板，照射設備為武漢大學人民醫(yī)院腫瘤中心放射治療設備。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖活力

將對數生長期人鱗狀細胞癌株Hep-2細胞鋪于4塊96孔培養(yǎng)板中，實驗分為2組：實驗組（2、4、8 Gy X線）和對照組（0 Gy X線），過夜貼壁后分別給予不同劑量X線照射。于照射后12、24、36、48 h每孔加入10 μL增強型CCK-8溶液，繼續(xù)孵育4 h后用酶標儀在450 nm處測定其吸光度OD值。細胞增殖活力由細胞存活率反映。細胞存活率=[（As-Ab）/（Ac-Ab）]×100%（As：即試驗孔，含有細胞的培養(yǎng)基、增強型CCK-8溶液，經放射線處理；Ac：即對照孔，含有細胞的培養(yǎng)基、增強型CCK-8溶液，未經放射線處理；Ab：即空白孔（空白組），不含細胞的培養(yǎng)基、CCK-8，未經放射線處理）。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡及細胞周期

同1.4法分組后細胞在培養(yǎng)箱內過夜貼壁，待6孔板內細胞密度達70%左右時，實驗組和對照組分別給予不同劑量X線照射，照射后2 h內換液后繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后依照試劑盒說明書步驟收集細胞并加入染料，于1 h內進行流式細胞儀測試，記錄并分析各組細胞凋亡率及細胞周期。

1.6 RT-qPCR檢測SHIP2 mRNA的相對表達量

細胞處理同前。設計引物，β-action：上游5′-GT？鄄CCACCGCAAATGCTTCTA-3′，下游5′-TGCTGTCACC？鄄TTCACCGTTC-3′；SHIP2：上游5′-TGTGGAAATCCTA？鄄CCCTG AAACT-3′，下游5′-GTAACTC CA ACCTCA？鄄AATGTCCC-3′。PCR反應結束后確認擴增曲線和溶解曲線，最終數據運用相對定量分析法進行分析。

1.7 Western-blot檢測SHIP2蛋白的相對表達量

細胞處理同前。按總蛋白提取試劑盒上操作說明提取Hep-2細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將40 μg蛋白樣品加入5×蛋白上樣緩沖液中，沸水浴10 min至蛋白變性。用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，將分離的蛋白電轉移至PVDF膜上。用10%脫脂牛奶常溫封閉1 h，接著加入一抗置于搖床上4℃過夜孵育，漂洗后加入二抗室溫下孵育1 h，再次漂洗。顯影后應用圖像分析軟件進行吸光度分析，最后計算蛋白的相對表達量（目的蛋白的相對表達量=目的蛋白吸光度/內參的吸光度）。

1.8 統(tǒng)計學方法

所有實驗數據采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Hep-2細胞增殖活力檢測結果

各組細胞分別給予不同劑量X線照射處理后12、24、36、48 h用CCK-8法檢測不同時間點各組樣本OD值。見表1。分析計算不同劑量射線處理后不同時間點的細胞增殖活力即細胞存活率。結果顯示，與0 Gy組比較，放射處理后各組Hep-2細胞活性均降低（均P < 0.05），且隨著放射劑量遞增，細胞增殖活力降低，48 h時最明顯（故后續(xù)實驗均選擇于處理后48 h時間點進行相關檢測）。見圖1。

2.2 Hep-2細胞凋亡情況

應用Annexin V-FITC/PI雙染經不同劑量X線處理后48 h的Hep-2細胞，通過流式細胞術定量分析得到細胞散點圖。見圖2。0 Gy組細胞凋亡率：（7.04±0.11）%；2 Gy組細胞凋亡率：（9.49±0.26）%；4 Gy組細胞凋亡率：（13.72±0.61）%；8 Gy組細胞凋亡率：（23.61±0.57）%。與0 Gy比較，放射處理后Hep-2細胞凋亡數明顯增加，且隨劑量增長效果明顯（均P < 0.01）。endprint

2.3 Hep-2細胞周期變化

應用PI單染不同劑量X線處理后48 h的Hep-2細胞，通過流式細胞術定量分析得到二維直方圖。見圖3。分析不同劑量射線處理后48 h Hep-2細胞各細胞周期所占比例。見表2。與0 Gy組比較，給予4、8 Gy X線照射處理的Hep-2細胞G2/M期所占比例與0 Gy組相比顯著增加（均P < 0.05），G1期和S期所占比例與0 Gy組相比降低（均P < 0.05）；給予2 Gy X線照射處理組各細胞周期無明顯變化（P > 0.05）。

2.4 SHIP2的表達情況

應用RT-qPCR檢測經不同劑量X線處理后48 h Hep-2細胞中SHIP2 mRNA的相對表達量，與0 Gy組比較，SHIP2 mRNA表達量水平顯著下調（均P < 0.01）。見圖4。應用Western-blot檢測不同劑量X線處理后48 h喉癌Hep-2細胞中SHIP2蛋白的相對表達量，與0 Gy組比較，SHIP2蛋白表達量水平顯著下調（均P < 0.01）。見圖5。

3 討論

喉癌為口腔咽喉部發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤[1]，其絕大部分病理類型為鱗狀細胞癌[2]。目前國際公認的主要治療手段為手術治療、放療和化療。對于早期喉癌，放療與根治手術治療的效果相當，且能為患者保留完整的發(fā)音及吞咽功能[3]。部分患者于放療過程中出現放射耐受現象，使得腫瘤的治療效果不佳甚至進展和復發(fā)，放療耐受已成為喉癌治療的瓶頸。

腫瘤的放射治療主要是通過電離輻射在細胞內產生大量高反應、不穩(wěn)定的自由基，間接作用于生物大分子，導致機體內以DNA為主的各種生物大分子結構改變、活性降低或喪失，最終引起被照射細胞的凋亡、周期阻滯、突變等后果[9-10]。已有不少研究證實，放射治療后DNA損傷修復是導致腫瘤產生獲得性放療耐受的重要機制，并且隨著研究的不斷深入，人們意識到細胞的氧合狀態(tài)、細胞周期、增殖活性等也與獲得性放療耐受密切相關，其本質是與輻射生物效應相關的各種基因編譯、基因多態(tài)性及表觀修飾造成放射敏感性的差異[4，11-13]。Aypar等[4]指出，接受放射后的和未接受放射的同一細胞系基因表型發(fā)生了改變，并猜測輻射所介導的基因不穩(wěn)定性與腫瘤的發(fā)生密切相關。Kim等[5]實驗表明，在人喉癌Hep-2細胞中，放療耐受株與普通喉癌Hep-2細胞相比，有多種放射敏感基因表型發(fā)生變化。因此要詮釋并解決喉癌的放療耐受問題，亟需尋找出與喉癌放療耐受相關的基因，為放療增敏和逆轉放療耐受尋找新靶點。

SHIP2是一種重要的肌醇磷酸酶，它通過其5'磷酸酶活性，選擇性地水解磷脂酰肌醇3，4，5三磷酸[PI（3，4，5）P3] 5′位點上磷酸生成磷脂酰肌醇3，4二磷酸[PI（3，4）P2]，而PIP2由PI3K催化合成PIP3[14]。PIP3作為重要的第二信使，調控著許多細胞活動，如細胞的生長、繁殖、凋亡、細胞骨架重排、細胞的趨藥性以及神經元的發(fā)育和功能。總的說來，SHIP2可通過對PIP3的調節(jié)而與腫瘤、炎癥、心血管疾病以及糖尿病等疾病相關聯[15-16]。鄒力等[17]提出SHIP2通過抑制PI3K/Akt信號傳導對胰島素敏感性進行負性調節(jié)。Elong等[18]發(fā)現，SHIP2調節(jié)細胞黏附途徑，并正向調控細胞的運動。

近年來，不斷有關于SHIP2與各種腫瘤之間的研究、猜想及分析，但在不同類別的腫瘤中發(fā)揮的作用不同，甚至表現出正性調控及負性調控兩種截然不同的作用：在乳腺癌、肝細胞肝癌、非小細胞肺癌、結直腸癌以及預后不良的患者中SHIP2均過度表達，而在胃癌中SHIP2的表達是下降的[6]。Fu等[19-20]的多個實驗比較了SHIP2在人肝細胞肝癌、非小細胞肺癌以及結直腸癌組織與其對應的癌旁組織的表達情況，結果均顯示出明顯的差異。Ye等[7]提出SHIP2在胃癌中表達下調，進而提高了胃癌細胞的PI3K/Akt信號通路的活性、促進了細胞增殖及腫瘤形成。Zhou等[21]比較喉鱗癌組織與癌旁組織中SHIP2的表達發(fā)現，SHIP2蛋白在喉癌中的表達明顯升高，且其表達與喉鱗癌T分級、臨床分級、淋巴結轉移或復發(fā)相關。故本研究認為SHIP2與喉癌的放療耐受相關，于是設計本實驗對SHIP2的表達與放射后喉癌細胞的增殖、凋亡及細胞周期的關系進行初步探究。

本實驗首先對X線處理后喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡及細胞周期的變化進行了檢測，結果顯示，X線照射后Hep-2細胞的增殖活力降低，細胞凋亡率增加、G2/M期阻滯增加，此結果可以由X線引起的DNA等生物大分子結構及功能的改變，進而引起細胞的凋亡、周期阻滯解釋。給予2 Gy X線照射處理的Hep-2細胞G2/M期阻滯與對照組相比，差異無統(tǒng)計學意義，考慮可能為輻射劑量較低對細胞造成的影響較小的原因。為了進一步探索輻射介導的SHIP2基因表型的改變或者基因表達水平的改變與喉癌放療耐受的關系，本研究對經不同劑量X線照射處理后48 h的Hep-2細胞中SHIP2 mRNA及蛋白相對表達量進行了分組比較，結果提示，照射后Hep-2細胞中SHIP2 mRNA及蛋白相對表達量較照射前明顯降低。由此筆者考慮輻射介導的SHIP2的下調表達可能是X線抑制Hep-2細胞增殖、促進其細胞凋亡、G2期阻滯的重要途徑。但是SHIP2在喉癌中是否也是通過PI3K/Akt信號傳導通路作用于細胞，并產生什么樣的調節(jié)，又是否與喉癌的放療耐受相關，今后計劃進一步建立喉癌放療耐受株后在上述信號通路各個水平上進行相關性驗證。

[參考文獻]

[1] Siegel RL，Miller KD，Jemal A. Cancer Statistics，2016 [J]. CA Cancer J Clin，2016，66（1）：7-30.

[2] 湯釗猷.現代腫瘤學[M].第3版.上海：復旦大學出版社，2014.endprint

[3] Jines TM，De M，Foran B，et al. Laryngeal caner：United King？鄄dom National Multidisciplinary guidelines [J]. Laryngeal Otol，2016，130（S2）：S75-S82.

[4] Aypar U，Morgan WF，Baulch JE. Radiation- induced genomic instability：are epigenetic mechanisms the missing link？ [J] Int J Radiat Biol，2011，87（2）：179-191.

[5] Kim JS，Kim SY，Lee M，et al. Radioresistance in a human laryngeal squamous cell carcinoma cell line is associated with DNA methylation changes and topoisomeraseⅡα [J]. Cancer Biol Ther，2015，16（4）：558-566.

[6] Ye Y，Qian XY，Xiao MM，et al. Decreased Sp1 Expression Mediates Downregulation of SHIP2 in Gastric Cancer Cell [J]. Int J Mol Sci，2017，18（1）.pii：E220.

[7] Ye Y，Ge YM，Xiao MM，et al. Suppression of SHIP2 contributes to tumorigenesis and proliferation of gastric cancer cells via activation of Akt [J]. J Gastroenterol，2016， 51（3）：230-240.

[8] Bao YY，Zhou SH，Lu ZJ，et al. Inhibiting GLUT-1 expression and PI3K/Akt signaling using apigenin improves the radiosensitivity of laryngeal carcinoma in vivo [J]. Oncol Rep，2015，34（4）：1805-1814.

[9] 陳猶白，柴密，烏蘭哈斯，等.放射性損傷：類型、癥狀和機制[J].中華損傷與修復雜志，2017，12（3）：203-206.

[10] 周妮娜，張利英，劉永琦，等.不同X線劑量照射對骨髓間充質干細胞的增殖及DNA損傷的影響[J].醫(yī)學研究生報，2016，29（9）：923-927.

[11] Pan Y，Zhang Q，Atsaves V，et al. Suppression of Jab1/CSN5 induces radio- and chemo-sensitivity in nasopharyngeal carcinoma through changes to the DNA damage and repair pathways [J]. Onco gene，2013，32（22）：2756-2766.

[12] Antwih DA，Gabbara KM，Lancaster WD，et al. Radiation-induced epigenetic DNA methylation modification of radiation-response pathways [J]. Epigenetics，2013，8（8）：839-848.

[13] Bae JH，Kim JG，Heo K. Identification of radiation-induced aberrant hypomethylation in colon cancer [J]. BMC Genomics，2015，16（1）：1-12.

[14] Erneux C，Edimo WE，Deneubourg L，et al. SHIP2 multiple functions：a balance between a negative control of PtdIns（3，4，5）P 3 level，a positive control of PtdIns（3，4）P 2 production，and intrinsic docking properties [J]. J Cell Biochem，2011，112（9）：2203-2209.

[15] Le CJ，Heredia GL，Lietha D. Expression，Purification，Crystallisation and X-ray Crystallographic Analysis of a Truncated Form of Human Src Homology 2 Containing Inositol 5-Phosphatase 2 [J]. Protein J，2016，35（3）：225-230.

[16] Thomas MP，Erneux C，Potter BV. SHIP2：Structure，Function and Inhibition [J]. Chembiochem，2017，18（3）：233-247.

[17] 鄒力，李法琦.SHIP2通過抑制PI3K/Akt信號通路降低胰島素敏感性[J].生理科學進展，2010，41（1）：62- 64.

[18] Elong EW，Ghosh S，Derua R，et al. SHIP2 controls plasma membrane PI（4，5）P2 Thereby participating in the control of cell migration in 1321 N1 glioblastoma cells [J]. J Cell Sci，2016，129（6）：1101-1114.

[19] Fu M，Gu X，Ni H，et al. High expression of inositol polyphosphate phosphatase-like 1 associates with unfavorable survival in hepatocellular carcinoma [J]. Int J Clin Exp Pathol，2013，6（11）：2515- 2522.

[20] Yang J， Fu M， Ding Y， et al. High SHIP2 Expression Indicates Poor Survival in Colorectal Cancer [J]. Dis Mar？鄄kers，2014，（3）：218 968.

[21] Zhou X，Liu Y，Tan G. Prognostic Value of Elevated SHIP2 Expression in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma [J]. Arch Med Res，2011，42（7）：589- 595.

（收稿日期：2017-09-20 本文編輯：王 娟）endprint