葡萄糖調節蛋白78在非酒精性脂肪性肝病發病中的作用*

王蘭綜述，楊云梅審校

非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）發病率逐年上升,已成為包括我國在內全球慢性肝病的首要原因，嚴重危害人民生命健康。非酒精性單純性脂肪肝預后一般比較好，進展很慢，隨訪10～20年肝硬化發生率低（0.6%～3%）。而非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH)卻可進一步發展、惡化成為終末期肝病，嚴重者可導致死亡[1]。目前NAFLD的發生發展機制至今仍尚不清楚，認為與氧化應激的增加、線粒體損傷、內質網應激和脂肪因子等因素相關[2，3]，但對導致進行性肝細胞損傷的機制有待于進一步探討。肝細胞內含有豐富的內質網，是蛋白質合成與翻譯后修飾，多肽鏈正確折疊與裝配的重要場所。在一些病理生理情況下，如肥胖、營養過剩導致未折疊或錯誤折疊的蛋白大量蓄積在內質網（endoplasmic reticulum，ER）引發內質網應激，為了維持ER穩態，細胞激活未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）。UPR是一種保守性細胞自我保護性措施,通過促進內質網對蓄積在內質網腔內的錯誤折疊或未折疊蛋白質的處理,使細胞功能恢復正常并使之存活。但是過強或者持續時間過久的內質網應激可引起細胞凋亡[4]。內質網應激在NAFLD發病機制中的地位越來越受到重視[5]。

葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）又名免疫球蛋白重鏈結合蛋白（the immunoglobulin heavy chain binding protein，Bip），與熱休克蛋白70（Hsp70）家族具有高度同源性，是Hsp70家族的成員之一。GRP78主要分布在細胞內質網中，其生物學功能主要有：阻止內質網內新生肽聚集；參與UPR調控；啟動內質網應激相關性細胞凋亡；參與內質網鈣穩態的調節[6]。GRP78作為一個重要的內質網應激蛋白，其在NAFLD的發生發展中的作用也不容忽視,現綜述如下。

1 GRP78的結構

GRP78定位于9號染色體長臂33區3帶，由654個氨基酸組成，具有高度保守的 EEVD氨基酸序列，與熱休克蛋白70（Hsp70）家族有高度同源性，是Hsp70家族的成員之一。 Hsp70的結構可分為：①44 kD部分（N端）。由4個α-螺旋形成 1個裂縫，裂縫底部帶有 ATP結合位點，是結合ATP的結構域，有ATPase活性；②18kD部分。由4個反相平行的β-折疊和1個α-螺旋構成，是多膚的結合部位；③10 kD部分（C端）。主要由α-螺旋構成，是活性調節區域，具有高度保守的EEVD氨基酸序列[7]。

GRP78主要作為ER伴侶及內質網應激標志物存在于內質網，很多研究表明，當腫瘤細胞的葡萄糖代謝改變等內在因素改變，及或腫瘤細胞體外因素（如糖剝奪、缺氧、酸中毒）等微環境因素改變后，GRP78的表達明顯增加，從而從內質網轉移到細胞表面，作為細胞信號轉導的受體發揮作用。同時，內質網應激也可以提高了GRP78基因1內含子保留，導致一種新的GRP78亞型表達的翻譯（grp78va），由于新亞型缺乏ER信號肽而定位在細胞漿中，調節UPR信號起到細胞保護的作用。在有些小鼠中，GRP78也存在于線粒體中，調節細胞增值和凋亡[8]。因此，GRP78可以出現在內質網以外的部位，如線粒體，細胞核，移位到細胞表面，甚至能被特定的細胞系主動分泌[9]。

2 GRP78的生物學功能

2.1 分子伴侶功能，維持內質網穩定 在生理情況下，GRP78在真核生物內質網膜上通過與新生多肽以非共價鍵形式短暫地結合，隨后松開，從而促進蛋白質的正確折疊和裝配，并協助蛋白質跨內質網膜轉運，降解錯誤折疊的蛋白質，維持內質網結構穩定。GRP78在應激反應調節時其基因的轉錄活性可提高10～25倍，表達量顯著增高，從而維持了內質網鈣穩態及內環境的穩定。饑餓的時候，GRP78通過ADP-核糖基化作用保存細胞內有限的營養。GRP78還能降低細胞對殺傷性T細胞的敏感性，阻止細胞凋亡。因此，近年來認為細胞受刺激時GRP78呈高表達并合成Bip/GRP78的反應，可能是細胞的一種重要的防御機制，該機制對細胞有保護作用，從而延長在各種不利因素刺激下的細胞生存期[10]。同時，GRP78還具有潛在的抑制細胞凋亡的作用，它主要通過抑制促凋亡分子BIK和caspase 7的活化從而發揮抗凋亡的作用。腫瘤細胞也存在GRP78的保護作用：GRP78可降低細胞毒性 T細胞對腫瘤細胞的殺傷力，促進腫瘤的生成和抗藥性產生，防止腫瘤細胞凋亡。GRP78缺乏可導致內質網腫脹，無法形成自噬體，因此抑制了應激誘導的細胞自噬[11]。

2.2 腫瘤細胞信號轉導的調節器 GRP78存在于腫瘤細胞的表面，可以作為腫瘤細胞的信號轉導和生存能力的重要調節器，通過PI3K/Akt信號轉導途徑促進腫瘤細胞的增殖[12]。1997年GRP78被發現存在于惡性淋巴瘤的淋巴細胞和白血病細胞的表面。陸續也有報道，GRP78存在于NG 108-15（一種神經母細胞瘤與膠質細胞瘤雜交的細胞），肺腺癌（A549）、結腸癌（LoVo）、黑色素瘤細胞（Me6652/4）、骨肉瘤細胞（SJSA-1）和肝癌細胞（HepG2）和胃癌細胞（23132/87）等腫瘤細胞的表面，通過與其他蛋白在細胞表面形成復合體，調節腫瘤細胞的信號轉導[13]。

2.3 調節內皮細胞的生存 GRP78在增值的內皮細胞和單核細胞的細胞表面表達，與這些細胞的的主要組織相容復合體（major histocompatibility complex，MHC）I形成復合體，調節內皮細胞的生存。由于腫瘤的進展通常需要腫瘤血管生成，從而保證腫瘤細胞的的營養和氧氣供應，抗血管生成可以阻止腫瘤生長[14]。人纖溶酶原Kringle 5已被證明可以結合增殖的內皮細胞表面GRP78，形成重組Kringle 5（recombinant Kringle 5；rK5），增強 caspase-7 活性，誘導血管內皮細胞和腫瘤細胞的凋亡[15]。更有研究報道，GRP78存在于動脈粥樣硬化斑塊內皮表面，負調控組織因子介導的凝血級聯啟動[16]。

2.4 GRP78可以作為病毒進入宿主細胞受體 有研究報道，柯薩奇病毒進入宿主細胞需要主要組織相容性復合體I類分子。GRP78后來被證明作為共受體與MHC I類分子在細胞表面形成復合體有助于病毒內化[17]。GRP78表達于肝癌細胞表面，可以作為2型登革病毒進入肝癌細胞的受體，登革病毒也可直接作用于GRP78的N端和C端，從而影響病毒的傳染性[18]。

2.5 分泌型的GRP8 在研究蛋白酶體抑制劑-硼替佐米抑制腫瘤血管形成的試驗中發現，一些腫瘤細胞系可以分泌高滴度的GRP78在腫瘤的微環境中[19]。在胃癌的蛋白質組學研究中發現，與正常人群相比，胃癌患者血清中GRP78的陽性率為28%。重要的是，在胃癌和肝癌的患者血清中檢測出GRP78自身抗體[20]。因此，分泌性GRP78能夠調節多種病理和生理中的生物學過程。

2.6 細胞漿GRP78 GRP78被發現在細胞漿中，主要調節UPR的信號轉導，病毒蛋白的組裝，通過修飾UPR信號，從而影響腫瘤細胞的生存[21]。最近的一項研究表明，GRP78蛋白可能通過掩飾其C-末端KDEL信號存在于胞漿的裝配室中[22]。

2.7 線粒體GRP78 最近研究發現，應激過程中，線粒體中的GRP78過表達可以保護星形膠質細胞的缺血損傷，降低了Ca2+從ER到線粒體，增加線粒體對Ca2+的吸收能力，減少自由基的產生，并保護呼吸鏈活性和線粒體膜電位穩定，提示GRP78可調節線粒體功能，如平衡能量消耗和維持線粒體穩態[23]。

2.8 細胞核GRP78 一個蛋白質組學的研究顯示，用γ線照射哺乳動物細胞時發現細胞核中的GRP78與DNA相互交聯，說明GRP78可以抵抗DNA損傷誘導的細胞凋亡[24]

3 GRP78在NAFLD發病中的作用

肝臟是維持機體穩態平衡的重要器官，參與機體糖代謝、糖原儲存、氨基酸和核苷酸的合成、血漿蛋白和激素的生物合成和脂質代謝。肝臟甘油三酯的產生受多種機制的調節，包括體內脂肪的合成，脂肪酵解，飲食脂肪的攝入和脂蛋白顆粒的運輸和分泌。氧應激、化學物質毒性、肝臟病毒感染、代謝紊亂，藥物的濫用和酒精的過多攝入均可引起內質網應激，損傷內質網功能，脂肪穩態失衡，導致脂肪肝。目前有關GRP78在NAFLD的發生發展中的研究的報道逐年上升。有研究報道，特異性敲除肝臟Grp78基因導致輕度脂肪肝和肝臟的損傷，而且會加重酒精、高脂飲食、藥物和毒素對肝臟的損傷，從而提示GRP78總的來說對肝臟起保護作用[25]。但同樣，閔敏[26]等人觀察了高脂飲食誘導大鼠NASH發病過程中內質網應激標志物GRP78的表達變化,結果表明，NASH組大鼠血清ALT、AST、FFA、TG和肝組織MDA水平均較對照組有不同程度的升高。肝組織GRP78基因和蛋白表達也隨 NASH 加重而增強,16周時升高最為顯著（P＜0.01）。因此，提示GRP78有可能通過啟動內質網應激,導致脂質異常沉積,參與了NASH的發生發展。拜明軍[27]等人探討了油酸（不飽和脂肪酸）和軟脂酸（飽和脂肪酸）對脂肪變性L02肝細胞凋亡和葡萄糖調節蛋白78（GRP78）表達的影響。結果顯示不同性質的脂肪酸均可導致L02細胞發生以甘油三酯升高為特點的脂肪變性，均可引起不同程度的肝細胞凋亡，軟脂酸組在48和72h的細胞凋亡率顯著高于對照組、DMSO組以及油酸組，同時伴有GRP78蛋白及mRNA表達的明顯增加。說明油酸不能影響GRP78的表達，飽和脂肪酸可能通過上調葡萄糖調節蛋白78的表達誘導脂肪變性肝細胞的凋亡。說明GRP78通過啟動內質網應激誘導肝細胞的凋亡。Li et al[28]研究顯示，大黃素對大鼠非酒精性脂肪肝有治療作用，可以降低非酒精性脂肪肝大鼠的體重、肝指數、血清TG，其主要機制是大黃素通過抑制GRP78，降低內質網應激，通過ERS-SREBP1c通路在果糖誘導的非酒精性脂肪肝的過程中發揮重要的作用。林勝利[29]等人通過對成年大鼠持續腹腔注射CCL4，發現大鼠肝組織中有大量的脂肪空泡形成，同時MDA水平和GRP78蛋白表達顯著升高，而牛磺酸和CCL4聯合作用的大鼠肝組織中，甘油三酯和膽固醇含量較單純用CCL4組明顯降低，且肝組織中MDA和GRP78含量顯著下降。結果表明，調節GRP78表達可抑制細胞內脂肪合成，CCL4刺激脂肪形成時GRP78升高也是一種內在的抗肝細胞脂肪堆積的保護機制。Wei et al在培養鼠H4IIE肝癌細胞時也發現，飽和脂肪酸（軟脂酸）能誘導內質網應激GRP78表達，激活caspase系列；不飽和脂肪酸（油酸 ）則不能[30]。在吳逸園[31]等人的進一步實驗研究中，通過RNAi特異沉默人肝癌HepG2內源性GRP78或過表達外源性GRP78，結果表明GRP78具有抑制生脂相關酶基因和SREBP-1轉錄因子的表達，降低HepG2細胞內的脂肪堆積的作用。

因此，我們可以推斷，在非酒精性脂肪性肝病的不同疾病譜階段，GRP78發揮著不同的作用。在單純性脂肪肝階段，GRP78表達升高，激活了未折疊蛋白反應，參與了內質網鈣穩態的平衡，維持著內質網穩態，抑制肝細胞內的脂肪蓄積。在非酒精性脂肪肝性肝炎階段，隨著內質網應激的不斷加強，GRP78表達升高，不足以抵抗內質網應激相關的細胞凋亡，隨著肝臟炎癥因子的不斷釋放，促使了NAFLD的進展。

近來研究表明，很少數NAFLD患者可進展為肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）[32]。目前關于 NAFLD 導致HCC的確切機制尚不明確。但NASH-隱源性肝硬化-HCC的發病模式已被眾多學者所認可[33，34]。White et al[35]回顧了一些縱向研究結果，探討了HCC在NAFLD/NASH的流行情況，結果表明，隨訪了NAFLD患者21年，HCC的患病率為0%～3%，其中最早一例發生在NAFLD診斷后5.6年。而且HCC在NAFLD-肝硬化中的發生率為2.4%，平均隨訪時間為7.2年。一項日本的臨床回顧性研究表明，既往大多數日本HCC的患者是在慢性丙型肝炎的基礎上發生的。近來，由于抗病毒治療和丙肝發病率的降低，非乙非丙型肝炎相關的HCC的發病率有所上升，有資料顯示大約10%的NAFLD患者進展為NASH，3%NASH患者進展為肝細胞肝癌。NASH相關的HCC的高危因素包括進展性肝纖維化、高齡、遺傳因素和飲食模式[36]。Arase et al隨訪了1600例≥60歲的NAFLD患者8.2年，NASH相關的HCC的發病率為0.63%[37]。因此，NASH相關HCC越來越受到研究者們的關注。然而，目前尚無簡單、快速和特異性檢測NAFLD/NASH相關HCC的腫瘤標志物。已有結果表明，Grp78f/f；Alb-Cre雄性小鼠隨著年齡增長肝臟不會出現惡性病灶，而Grp78f/f;Alb-Cre雌性小鼠在長期酒精喂養后會出現DNA甲基化的改變和ERAD基因的表達，標志著肝臟出現腫瘤樣包塊。與單純敲除腫瘤抑制因子PTEN基因相比，同時敲除肝臟GRP78和PTEN基因，小鼠會出現肝腫大，脂肪肝，肝損傷和肝細胞增殖，形成肝細胞肝癌和膽管細胞癌，說明GRP78促進腫瘤的生成[38]。我們知道，GRP78不僅維持內質網穩定，還可以存在腫瘤細胞表面，調節重要的信號轉導促進腫瘤細胞的增值。因此，GRP78在NAFLD相關肝癌的發生中是否發揮重要的作用，目前尚未見文獻報道，我們相信隨著對GRP78蛋白的深入研究，將有助于探討NASH相關HCC發病機制，為HCC的早期預防和早期發現提供理論依據。

4 GRP78的研究展望

近來研究表明，GRP78可以定位在細胞內的多個細胞器與細胞應對各種應激的適應性生存密切相關[39]。內質網應激是如何促進GRP78從內質網移位到細胞表面、細胞漿和線粒體的機制有哪些？細胞胞漿中的GRP78的相互作用伴侶有哪些？影響了哪些信號轉導通路？GRP78在NAFLD/NASH相關HCC中是否及如何發揮作用？我們相信，隨著對GRP78蛋白的更深入研究，有助于我們挖掘出NAFLD的新的發病機制，為NASH的早期阻斷，預防NAFLD相關肝癌的發生提供理論依據。

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