胰高血糖素樣肽-1改善非酒精性脂肪性肝病作用機制研究進展*

信豐智綜述，曹海霞，范建高審校

隨著生活方式的改變，非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）已成為我國乃至全球慢性肝病的首要病因。然而，目前國內外指南均缺乏可靠的藥物治療建議。近期研究表明，胰高血糖素樣肽-1長效類似物（glucagon-like peptide-1 receptor agonists，GLP-1RAs）可有效控制NAFLD患者體重，改善其肝臟組織病理學，有望成為NAFLD藥物治療新選擇。因此，進一步明確GLP-1RAs改善NAFLD相關作用機制對NAFLD發病機制闡釋、藥物治療靶點探索具有非常重要的意義。

1 GLP-1RAs概述

機體對胰高血糖素原的轉錄后修飾具有組織特異性，通過不同的剪切方式可獲得不同功能的轉錄產物。如在胰島細胞中可獲得胰高血糖素、主要胰高血糖素原片段（major proglucagon fragment，MPGF)。腸道L細胞可對MPGF進一步剪切，生成胰高血糖素樣肽-1（glucagon-like peptide 1，GLP-1）、胰高血糖素樣肽 -2（glucagon-like peptide 2，GLP-2）等多肽。GLP-1是一長度為30個氨基酸的短肽，進化上相對保守。進食等因素可刺激腸道L細胞合成并分泌GLP-1。GLP-1作用于屬于G蛋白偶聯受體家族（G-protein-coupled receptors， GPCRs） 的 GLP-1 受 體（GLP-1 receptor，GLP-1R），促進胰島素分泌，抑制胰高血糖素分泌，調節餐后血糖水平；抑制腸道蠕動，起到“回腸剎車”作用；同時還可作用于下丘腦及腦干傳入神經元，調節副交感神經沖動發射，參與調節食欲與進食量。

生理性GLP-1迅速被二基肽酶IV（enzyme dipeptidyl peptidase IV，DDPIV）降解滅活，不足25%的GLP-1來自腸道分泌，又因肝臟滅活作用，最終只有10-15%GLP-1進入外周循環[1]。故生理性GLP-1穩定性差，難以用于臨床，通過化學修飾或分子模擬得到GLP-1RAs，使其在具有與天然GLP-1相似生理功能的同時具有更好的穩定性、更高的血漿蛋白結合率及更長的半衰期。如用精氨酸取代GLP-1第34位賴氨酸，并于第26位賴氨酸上增加由谷氨酸介導的16碳棕櫚酰脂肪酸側鏈獲得利拉魯肽（Liraglutide，LRG），而艾塞那肽則是從墨西哥巨蜥蜴毒液中分離出來的一種含有39個氨基酸的多肽序列，與GLP-1具有53%同源性。臨床研究提示GLP-1RAs可模擬天然GLP-1功能，同胰島素聯用不增加嚴重低血糖發生風險[2]。GLP-1RAs還可顯著控制體重，降低標準化治療2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）患者心血管事件發生風險[3]，這提示GLP-1RAs在糖尿病并發癥控制中起著重要作用。

2 GLP-1與NAFLD

NAFLD是一種與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）和遺傳易感性密切相關的代謝應激性肝臟損傷，其疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、非酒精性脂肪性肝纖維化及肝硬化等類型。NAFLD發病率為15%-40%[4]，近二十年亞太地區NAFLD亦呈迅速增長。目前已出版的NAFLD指南仍無可信程度高的標準化藥物治療推薦方案[5]，諸如飲食控制、運動處方及外科手術等治療手段均存在一定不足，這使得NAFLD的綜合管理存在一定困難。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是NAFLD的核心機制，且糖尿病和NAFLD密切相關。最新研究發現，GLP-1（RAs）可以改善NAFLD患者脂質代謝，減輕炎癥反應，延緩疾病進展。

2.1 GLP-1與NAFL 肝腺泡3區大泡性或以大泡為主的混合性肝細胞脂肪變，伴或不伴有肝細胞氣球樣變是NAFL典型病理表現[6]。在GLP-1（RAs）應用于T2DM治療中，人們發現了其潛在的肝臟獲益。Dutour et al[7]證實同標準化口服降糖藥治療相比，單用艾塞那肽可顯著降低T2DM患者心外膜脂肪組織及肝細胞甘油三酯含量。聯用吡格列酮及艾塞那肽較單用吡格列酮可顯著降低T2DM患者肝臟脂肪含量，且這種獲益獨立于減重之外，這提示GLP-1RAs可能對肝臟存在直接作用[8]。Gupta et al[8]發現人肝細胞表面表達有GLP-1R，Den Besten[9]證實NAFL及NASH人群存在葡萄糖介導的GLP-1分泌異常，與對照組相比，NAFL及NASH組分泌水平顯著下降，這對上述假說提供了進一步理論支持。但考慮到NAFL本身進展緩慢，如何界定NAFL中相對高風險人群以及確定合適藥物干預時機、藥物干預劑量尚需大規模臨床研究深入探索。

2.2 GLP-1RAs與NASH 同NAFL不同，NASH患者因反復肝臟炎癥活動所致肝臟損傷，具有更高肝纖維化及肝硬化發生風險[4]。NASH患者具有更高的肝臟相關疾病死亡風險。故對NASH患者人群及時進行綜合干預，對延緩疾病進展及改善預后至關重要。而藥物干預往往是此階段患者的良好選擇。

體外實驗已經證實應用GLP-1RAs可顯著改善游離脂肪酸（free fatty acids，FFAs）誘導的肝癌細胞系脂肪變程度，降低胞內甘油三酯水平[10]。Ding[11]證實艾塞那肽可有效改善ob/ob小鼠高胰島素血癥及肝臟組織學病變；Mells[12]證實LRG可顯著緩解肥胖模型小鼠肝臟炎癥程度及血脂水平；Gao[13]證實LRG可顯著緩解高脂誘導脂肪肝模型大鼠肝臟脂質沉積及血清ALT水平。

Armstrong et al[14]開展的臨床試驗進一步證實了上述動物實驗的結論。該臨床試驗為多中心隨機雙盲安慰劑對照研究，52例合并超重的NASH患者隨機分為兩組，分別接受LRG或安慰劑治療48周，結果提示同安慰劑組相比，LRG可顯著降低NASH患者血清γ-谷氨酰轉肽酶（gamma glutamyl transpeptidase，GGT）水平，改善包括氣球樣變及脂肪性肝炎在內的組織學損傷，延緩NASH患者肝纖維化進展。這是首個從組織學水平上驗證GLP-1RAs對NASH影響的臨床試驗，對GLP-1（RAs）與NAFLD關系的探討具有重大意義。該試驗揭示了GLP-1RAs在NAFLD中的潛在應用價值，但GLP-1RAs對肝細胞具體的作用機制仍不明確。進一步探索有助于明確改善NASH組織學損傷、延緩病情進展的合理用量，探索超過治療T2DM常規劑量是否可能帶來的潛在風險是決定GLP-1RAs能否真正用于臨床，同時也是尋找新的NASH藥物靶點的關鍵。

2.3 GLP-1RAs與肝纖維化和肝硬化 肝纖維化及肝硬化是包括NAFLD在內眾多慢性肝病的終末期表現，已進展至肝纖維化及肝硬化患者更易出現代謝異常，約80%肝硬化患者存在糖代謝異常，30%合并有糖尿病。而糖尿病會顯著增加肝硬化患者肝臟并發癥及死亡風險[15]，故改善肝硬化患者代謝紊亂對延緩其疾病進展，提高生存質量十分關鍵。

Junker et al[16]對不合并糖尿病Child-Pugh A或B級肝硬化病人進行50g口服糖耐量實驗，雖肝硬化組GLP-1分泌水平提高，但其腸促胰素效應明顯受損，提示肝硬化病人糖代謝紊亂與GLP-1分泌異常及敏感性改變相關。GLP-1（RAs）可能通過調節肝硬化患者代謝狀態改善其預后。

肝星形細胞（hepatic stellate cells，HSC）在肝纖維化的發生發展中具有重要作用。體外實驗證實LRG可抑制肝星形細胞增殖，且該效應具有劑量依賴性。Kahal[17]發現LRG可降低肥胖女性血清肝纖維化指標Ⅲ型前膠原氨基末端肽（procollagen type 3 amino-terminal peptide，PⅢNP）水平。但GLP-1（RAs）是否可以有效延緩有組織學證實的肝纖維化進展尚需進一步臨床試驗證實。

3 GLP-1RAs改善NAFLD作用機制

3.1 GLP-1與脂質代謝 肝臟在脂質代謝中起著重要作用，長期游離脂肪酸（free fatty acids，FFAs）沉積可干擾多條代謝通路并誘發外周IR；其作為“第一次打擊”還可介導促炎因子分泌，加重肝細胞損傷、促進肝纖維化進展。

既往研究結果強調GLP-1（RAs）對脂質氧化的作用，Mells et al[12]已在動物實驗水平上證實LRG可上調長鏈脂酰輔酶 A 脫氫酶（long-chain acyl-CoA dehydrogenase，LCAD）、過氧化物酶酰基輔酶A氧化酶2（ACOX2）等脂肪酸β氧化相關蛋白mRNA表達。研究結果提示GLP-1（RAs）可能通過促進肝細胞對長鏈脂肪酸代謝，進而緩解肝臟脂質沉積及其帶來的內質網應激等細胞損傷。而近年來人們開始關注GLP-1（RAs）對脂質從頭合成（De novo lipogenesis，DNL）的影響。DNL指利用葡萄糖、氨基酸等非脂質前體合成脂肪酸的過程，高胰島素血癥可上調肝臟DNL并加重肝臟IR，形成惡性循環。故DNL對NAFLD脂質沉積及疾病進展起重要作用[18]。Armstrong et al[10]臨床試驗證實了LRG可顯著下調經組織學證實的NASH患者DNL水平，且此種獲益可獨立于減重之外。有趣的是，該試驗利用同位素示蹤法并未發現GLP-1RAs可提高肝細胞脂肪酸β氧化水平。上述結果提示GLP-1RAs可調節肝臟脂質代謝，但其具體機制仍需進一步探究。

3.2 GLP-1RAs與炎癥因子 “二次打擊”學說是闡釋NAFLD病理生理機制的經典假說。炎癥刺激作為“第二次打擊”會加重NAFLD患者肝臟病變，促進疾病進展。已有研究證實長期輕度炎癥刺激與NASH發生發展密切相關[19]，降低NALFD患者炎癥因子，平，控制肝臟炎癥反應，不僅有助于改善組織學病理改變，更可延緩疾病進展，改善患者預后。

已有研究證實肝細胞腫瘤壞死因子相關受體3（tumour necrosis factor receptor-associated factor 3，TRAF3） 可 與TGF-β 激酶 -1（TGF-β-activated kinase 1，TAK1）結合，介導TAK1泛素化及自身磷酸化，從而促進下游IKKβ-NF-κB及MKK-JNK-IRS1信號通路表達，在高脂誘導脂肪肝模型發病中發揮重要作用[19]。

Hirataet et al[20]證實艾塞那肽可顯著降低脂多糖誘導體外平滑肌細胞TNF-α表達；Solmaz[21]證實艾塞那肽可下調鏈脲佐菌素（STZ）處理SD大鼠腦TNF-α水平；Zhang等[22]證明了LRG可顯著下調ApoE基因敲除小鼠肝臟TNF-α mRNA表達，Chen等[23]發現高脂飲食可上調SD大鼠TNF-α mRNA表達，應用艾塞那肽6周可以顯著下調TNF-α mRNA水平。上述結果提示GLP-1RAs可通過下調TNF-α水平，減輕肝臟炎癥反應，改善NAFLD。

IL-6是一種具有多種功能的細胞因子，其與增殖、分化等多種細胞活動密切相關。在糖尿病、動脈粥樣硬化、各種類型肝炎、肝細胞癌等多種疾病中均可發現IL-6表達及調節異常[24]。He等[25]發現GLP-1可降低外周脂肪組織IL-6水平，Kugelmas[26]發現同對照組相比，NASH患者人群血清IL-6水平升高。Chen證實應用艾塞那肽9周可以顯著降低高脂飲食誘導脂肪肝小鼠模型肝臟IL-6 mRNA表達。這提示GLP-1RAs可通過抑制炎癥水平起到預防及控制肝脂肪變進展。

3.3 GLP-1與自噬 自噬是一類將受損或多余細胞器靶向運輸至溶酶體進行降解的受到嚴格調控的細胞內生命活動，在真核細胞中廣泛存在，常于饑餓及損傷等應激條件下激發，是生命體的一種自我保護機制。

自噬標記蛋白LC3-Ⅱ的表達在肝脂肪變中明顯增加。Singhet et al[27]發現自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤可以顯著上調肝細胞脂肪變細胞模型細胞內甘油三酯水平，而自噬激活劑雷帕霉素則可有效緩解肝細胞內脂質沉積。長期高脂飲食誘導的脂肪肝小鼠存在肝臟自噬紊亂，其可導致內質網應激，加重胰島素抵抗，同時自噬與FFAs誘導的肝細胞凋亡亦存在交互作用，這提示自噬對NAFLD發生進展具有重要作用。

細胞營養狀態是調節自噬水平的關鍵因子，營養狀態的改變可誘導相關激素及神經遞質分泌，調節細胞自噬水平。近年研究發現GPCRs可作為營養狀態感受器調節自噬。GLP-1作為餐后血糖調節激素，其分泌與營養狀態改變密切相關。Yin et al[28]證實LRG可通過促進胰島細胞系INS-1細胞自噬改善FFAs介導的細胞凋亡。Abe et al[29]證實艾塞那肽可改善存在自噬損傷的胰島β細胞功能，調節高脂飲食誘導小鼠血糖、胰島素水平。Zhou et al[30]發現LRG可通過提高細胞自噬水平改善體外FFAs誘導的永生化肝細胞系L-02細胞脂質沉積。上述結果提示GLP-1RAs可通過調節肝臟自噬改善NAFLD，但其具體作用靶點尚需進一步實驗證實。

3.4 GLP-1改善NAFLD相關信號通路 NAFLD疾病進程受多條信號通路調控，已有實驗證實GLP-1RAs可通過調節代謝相關信號通路分子改善NAFLD。

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是調節細胞能量代謝的關鍵分子，對機體維持正常葡萄糖代謝至關重要，其激活受到胞內AMP/ATP影響。Xu et al[31]認為，GLP-1RAs通過NAD+依賴去乙酰化酶家族成員SIRT1介導AMPK磷酸化，下調肝細胞脂質代謝及炎癥反應。Ben-Shlomo et al[32]證實GLP-1可通過升高肝細胞內cAMP水平，介導AMPK磷酸化，抑制下游脂質合成基因表達，下調肝細胞脂質合成水平。AMPK同樣參與調節自噬水平，其活化后可通過mTOR通路上調自噬水平。He[33]證實LRG可通過介導AMPK磷酸化，抑制下游mTOR磷酸化水平，上調自噬水平，改善FFAs介導的甘油三酯堆積及HFD介導的肝臟脂質沉積。

JNK屬于絲裂素化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）家族成員，其被特異性的JNK激酶-1或絲裂素化蛋白激酶-4（mitogen-activated protein kinase kinase 4，MKK4）磷酸化激活并活化下游通路，最終促進包括TNF-α、IL-6在內的多種促炎因子表達，介導多種胞內及胞外應激反應，已有研究證實了JNK信號通路在NAFLD中的作用[34]。Zhang[22]證實GLP-1RAs可下調MKK4 mRNA表達水平，抑制JNK磷酸化從而抑制JNK信號通路激活，改善肝臟炎癥反應。

綜上所述，目前動物實驗及臨床試驗均提示GLP-1（RAs）具有改善NAFLD的作用。明確NAFLD患者使用GLP-1RAs適應癥及禁忌癥，確定合理用量，監控藥物不良反應是決定其能否用于臨床治療NAFLD的關鍵。進一步探索GLP-1改善NAFLD的分子機制，不僅可以為GLP-1在NAFLD領域臨床應用提供理論支持，更有助于明確NAFLD發病機制、尋找嶄新的藥物作用靶位。

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