羥基喜樹堿對甲狀腺相關眼病球后成纖維細胞增殖和凋亡的影響

彭細峰　鄧江濤　葉靜梅　姜文浩

[摘要]目的觀察羥基喜樹堿對體外培養的球后成纖維細胞增殖和凋亡的影響。方法甲狀腺相關眼病患者球后成纖維細胞體外培養。免疫組織化學染色檢測波形蛋白在球后成纖維細胞中的表達。將不同濃度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L組）作用于球后成纖維細胞48h，用MTT法檢測各組藥物對細胞增生的抑制率。流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡率。提取細胞內總蛋白、采用Western blotting法檢測活化型caspase-3和caspase-3、bax和bcl-2、p-JNK和JNK、p-AKT和Akt在HCPT中的表達。結果MTF法顯示不同濃度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L組）能降低成纖維細胞細胞的A值（P<0.05），細胞生長抑制率隨藥物濃度的增加而增加。流式細胞儀檢測凋亡率隨著濃度的增加而增高；Western blotting法檢測結果證明，活化型caspase-3、bax、p-JNK表達的灰度值明顯增加，差異均有統計學意義。結論羥基喜樹堿能誘導體外培養球后成纖維細胞，其作用呈劑量依賴性。

[關鍵詞]羥基喜樹堿；甲狀腺相關眼??；球后成纖維細胞；凋亡

[中圖分類號]R771.3 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）17-26-04

甲狀腺相關眼?。╰hyroid associated ophthalmopathy，TAO）發病率居眼眶疾病之首。它的發病機制目前還不完全清晰，研究表明TAO是一種自身免疫或器官免疫性疾病。球后成纖維細胞（retroocularfibroblasts，RF）在TAO發病中起至關重要作用。因此，怎樣抑制球后成纖維細胞的增生，找到最佳的治療方法是目前臨床上急需要解決的問題。有實驗證實，羥基喜樹堿（hvdroxycamptothecin，HcPT）可以對抗腫瘤，而且可以對抗纖維化。本實驗研究羥基喜樹堿對體外培養的TAO患者球后成纖維細胞增殖、凋亡的影響，并從細胞傳導通路的途徑探討羥基喜樹堿對球后成纖維細胞可能作用機制。

1材料與方法

1.1一般材料

眼眶脂肪組織5例來自于2016在深圳市龍崗中心醫院行眼眶減壓手術的TAO患者，他們均為靜止期患者，其中男3例，女2例。5例手術患者都符合TAO的診斷標準，且排除了其他自身免疫性疾病和腫瘤相關性疾病等。5例患者術前均已經簽署知情同意書。手術時期的甲狀腺功能正常達半年。羥基喜樹堿（純度≥99%，成都蘭貝植化有限公司，批號100903）；鼠抗人波形蛋白抗體、羊抗鼠Cy3熒光抗體（sc-166894，Sigma，美國）；CCK-8試劑盒（Promega，美國）；兔抗人caspase-3抗體，ab71481），兔抗人活化型caspase-3抗體，ab32042）、兔抗人bax抗體（ab32503）、兔抗人bcl-2抗體（ab2123）、鼠抗人B-actin抗體（ab6276）（Abcam，英國）、兔抗人JNK抗體（9258）、兔抗人p-JNK抗體（4668）（CST，美國）、羊抗鼠二抗（sc2058）、羊抗兔二抗（sc2007）（Santa，美國）、ECL顯影液（Millipore，美國）、臺式離心機、流式細胞儀（BD FACSCalibur，美國）。

1.2方法

1.2.1球后纖維細胞的培養和鑒定 手術中取出的眼眶組織放入培養瓶。用組織塊法培養原代細胞，選其中的第2代到第6代細胞進行實驗。免疫組織化學染色鑒定：對數生長期的細胞接種到培養皿，待細胞長至半滿后，將玻片取出，免疫組化染色制片。一抗用兔抗人波形蛋白單克隆抗體，二抗用生物素化羊抗兔IgG。

1.2.2對細胞生長影響的檢測 （1）空白對照組：加單細胞懸液和與藥物處理組相同體積DMSO溶劑，不加其他藥物，使DMSO在培養液中的濃度保持在≤1%；（2）藥物處理組：細胞懸液中加入5種不同質量濃度的HCPT，使它的終濃度為1、5、10、50、100mg/L。將1×10⁴個/mL的成纖維細胞接種于96孔板，每孔200μL體積，第1孔加和藥物處理組等同體積的培養液，不加細胞及任何藥物，設定為空白空白對照組孔?？瞻讓φ战M設置4個重復孔，各藥物處理組設置4個重復孔。培養48h后每孔加入MTT溶液，37℃培養4h后去除上清液，每孔分別加入150μL DMSO，震蕩10min后等待結晶溶解。空白孔設為零，用酶聯免疫檢測儀測490nm波長的光吸收值。計算各組的細胞生長抑制率，求平均值。細胞生長抑制率（%）=（空白對照組A490-藥物處理組A490）/空白對照組A490×100%。

1.2.3流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將4×10⁴/mL細胞接種于培養瓶，每瓶5mL（2×10⁵細胞），總共18瓶（每濃度3瓶）?？瞻讓φ战M為RPM11640培養的成纖維細胞，藥物處理組加入不同質量濃度的HCPT（1、5、10、50、100mg/L），培養48h，收集于離心管，1000rpm離心5min后，PBS洗滌2次，70%的乙醇進行固定，4℃以下過夜。PI染色，流式細胞儀進行檢測。

1.2.4Western blot法檢測 caspase-3、活化型caspase-3、bax、bcl-2、p-JNK、JNK、p-AKT和Akt在HPCT中的表達 取空白對照組、1、5、10、50、100mg/L HCPT組處理48h的細胞，倒出培養液，預冷PBS洗3遍。加入含有100mmol/L PMSF裂解液400μL，冰上裂解30min。離心半徑4cm，4℃ 12000dmin離心5min后，去除上清液后用BCA法進行測定，調至等質量濃度。按順序行質量分數10%SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF進行轉膜，質量分數5%的脫脂牛奶予以封閉2h，4℃封閉，一抗過夜，TBST進行清洗3次后曝光顯影，采用計算機軟件分析灰度值并記錄，以目的蛋白/β-actin進行灰度值校正，計算各組灰度值比例，再計算出活化型caspase-3/caspase-3、bax/bcl-2、p-JNK/JNK、p-AKT/Akt的比例，以百分數表示。

1.3統計學處理

本研究采用SPSS14.0統計軟件進行數據統計與分析。計量資料以（x±s）表示，各組數據采用重復測量的方差分析，各藥物處理組與空白對照組比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1球后成纖維細胞免疫組化鑒定

SP法染色體外培養的球后成纖維細胞見波形蛋白表達陽性，位于胞漿，與成纖維細胞長軸方向一致的網狀結構和棕黃色束狀結構；細胞角蛋白表達陰性。

2.2MTT檢測HCPT對RF增殖的作用

不同濃度HCPT干預成纖維細胞48h后，MTT法檢測細胞的吸光值（A值）及計算出的平均細胞生長抑制率分別見表1。藥物處理組與對照組細胞A值的差異均有統計學意義（P<0.05）。見表1。

2.3不同濃度HCPT作用后RF的凋亡情況

空白對照組細胞的凋亡率（0A3±0.16）%，各藥物濃度作用下成纖維細胞凋亡率均比空白對照組凋亡率高，與空白對照組比較，差異有統計學意義（P<0.05）。組間比較差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

2.4活化型caspase-3/caspase-3、bax/bd-2、p-JNK/JNK、p-AKT/AKT在不同藥物處理組RF中的表達變化

Western blot法檢測結果表明，活化型caspase-3、bax、p-JNK在空白對照組RF中僅有少量表達，在HCPT處理組中的表達明顯多于空白對照組，差異均有統計學意義（P<0.05）。組間比較，差異均有統計學意義（P<0.05）。Bcl-2、p-AKT在空白對照組RF中的表達量最高，在HCPT處理組中的表達隨著濃度的增加表達量下降，差異均有統計學意義（P<0.05）。不同濃度HCPT干預球后成纖維細胞48h后，采用重復測量方差分析，細胞的活化型caspase-3/caspase-3、bax/bcl-2、p-JNK/JNK、p-AKT/Akt的比例值差異有統計學意義（P<0.05）。見圖1、表3。

3討論

甲狀腺相關眼病又稱Graves眼病，內分泌突眼。國內外對甲狀腺相關眼病的研究呈上升的趨勢。由于發病機制尚不明晰，各種治療方法的效果都不是特別理想。成纖維細胞的增殖在多種眼病中擔任著重要角色，例如增殖性玻璃體視網膜病變、青光眼手術后疤痕組織增生、翼狀胬肉的發生發展及復發等。有研究證實，球后成纖維細胞既是TAO發展中的靶細胞，同時也是效應細胞，參與及完成了多個免疫反應。臨床圍繞抗纖維化，試驗了5-氟尿嘧啶、絲裂霉素、環孢霉素A、全反式維甲酸、秋水仙堿等多種藥物，可這些藥物的毒性作用、副作用都比較大，因此在臨床使用比較局限。羥基喜樹堿是從珙桐科植物喜樹中提取出來的一種生物堿，剛開始用于抗腫瘤，有毒、副作用偏小、水溶性好、患者易耐受等特點，它主要通過抑制細胞增生、誘導凋亡、影響細胞周期等機制發揮作用，在非腫瘤性疾病等方面也發揮了重要作用。已有研究證實羥基喜樹堿可以抗纖維增生。但對體外培養的TAO患者球后成纖維細胞的增殖是否有影響還沒有見研究報道。我們采用體外培養細胞的方法，觀察HCPT對球后成纖維細胞增殖的影響，發現1、5、10、50、100mg/L HCPT作用于球后成纖維細胞48h后，能抑制TAO患者球后成纖維細胞的增殖；而且隨著藥物濃度增加，MTT法所測得的吸光值降低，抑制率增高；提示HCPT是呈劑量依賴性的方式抑制球后成纖維細胞的增殖。研究的結果和其他學者研究的結果是一致的。因此我們推測當較高濃度的HCPT作用于球后成纖維細胞時，有可能誘導了球后成纖維細胞的凋亡。

在HCPT處理體外培養的RF通過什么樣的途徑誘導凋亡？本實驗從細胞信號傳導通路方面進行了研究。正常組織的代謝需要組織增殖和凋亡維持平衡才能進行。多種調節細胞增殖與凋亡的基因/蛋白參與了球后成纖維細胞增殖。與細胞凋亡密切相關的基因有Bcl-2和Bax蛋白，Bcl-2基因是一個長壽基因，Bcl-2基因位于第18號染色體，Bcl-2蛋白在介導細胞凋亡途徑中起著非常關鍵的作用，通過調控內質網中的鈣離子參與的物質轉運以及膜通透性轉換從而阻止細胞色素C從線粒體中釋放出來，達到阻止細胞凋亡的反應，它主要通過抵抗細胞的死亡延長細胞的壽命，從而引起細胞的數目增多，即是抑制細胞凋亡。Bax基因促進細胞的凋亡。兩者的比例決定了細胞的凋亡。Bcl-2先要與Bax結合成二聚體才可以抑制細胞的凋亡。Bcl水平降低則不能平衡Bax的作用，引起細胞發生凋亡，反之則導致細胞的增殖。有實驗證明，HCPT能誘導細胞凋亡，機制可能與下調Bcl-2基因表達有關。本實驗采用流式細胞檢測儀測到不同質量濃度的HPCT處理球后成纖維細胞48小時后，胞內Bcl-2蛋白的表達水平與空白對照組比較有降低，提示可以降低Bcl-2的表達水平是HPCT誘導成纖維細胞細胞凋亡的機制之一。Caspase-3是細胞凋亡激活中重要的蛋白，它在細胞凋亡的過程中起著最后執行作用。它平常以無活性的前體形式存于細胞中，當細胞受到某些凋亡信號刺激時，caspase-3隨即可裂解為活化型的caspase-3，并且通過酶切特異性底物拆散細胞骨架，組織DNA的修復，干擾信使核糖核酸的剪切，從而誘導細胞凋亡。JNK是信號蛋白，其通過磷酸化而激活發揮生物效應。P-JNK可以下調bcl-2，c-IAPI通過線粒體途徑誘導細胞的凋亡。AKT磷酸化激活可以促進細胞增生，抑制細胞凋亡，本研究結果顯示，p-AKT的表達量隨著HCPT濃度的增加反而降低，提示AKT保護作用的減弱是本實驗促進細胞凋亡的很重要的因素。

本實驗研究結果表明，HCPT能抑制球后成纖維細胞增殖，可以誘導細胞凋亡，且呈劑量依賴性，提示HCPT在治療TAO方面有良好前景，為今后TAO臨床研究提供了新的思路和方向。目前的研究僅局限于離體的實驗，體內的試驗效果如何，有待進一步研究。

（收稿日期：2017-05-02]