以TNF—α刺激A549細胞構建急性肺損傷細胞模型

吳煒景　張家敏　李立平

[摘要]目的構建急性肺損傷體外細胞模型。方法以TNF-α 10ng/mL刺激肺泡Ⅱ型上皮A549細胞，采用酶聯免疫吸附法檢測細胞上清液中IL-4、IL-1 B濃度，比色法檢測丙二醛濃度、總超氧化物歧化酶活力，RT-PCR及免疫印跡法分別檢測NF-K B mRNA及蛋白的表達水平，流式細胞術檢測細胞凋亡率。結果以TNF-α刺激A549細胞，細胞上清液IL-1β、IL-4濃度上升；細胞內丙二醛增多，超氧化物歧化酶活力下降；NF-кB在基因及蛋白水平表達上調（P<0.05）。結論以TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮A549細胞可誘導炎癥反應放大、氧化應激失衡、NF-кB通路活化、細胞凋亡增加，符合急性肺損傷的主要特點，可作為ALI體外細胞模型。

[關鍵詞]急性肺損傷；細胞模型；炎癥反應；肺泡Ⅱ型上皮細胞；核因子кB；

[中圖分類號]R563.1；R563.8 [文獻標識碼]A [文章編號]2095-0616（2017）17-30-03

急性肺損傷（acute lung iniury，ALI）是臨床常見急危重癥，以進行性加重的呼吸困難、頑固的低氧血癥為臨床特征，其嚴重階段可發展為成人呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）。感染、有害物質吸入、外傷、休克、中毒等多種非心源性致病因素是引起急性肺損傷的常見因素，ALI/ARDs缺乏特效治療，發病率及病死率均處于高水平，因而其發病機制研究仍受科學家重視。急性肺損傷模型構建是ALI機制研究的基礎，在細胞模型上進行研究，再將實驗成果在動物模型上進行驗證，有利于降低動物實驗的成本，提高成功率。本研究結合急性肺損傷發生時，肺泡Ⅱ型上皮細胞在炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、通路激活等方面的特點，對ALI細胞模型的構建進行探討。

1材料與方法

1.1材料

A549細胞由福建醫科大學附屬第二醫院中心實驗室提供，RPMI-1640培養基、小牛血清、胰酶來自于Hyclone公司，重組人腫瘤壞死因子-α購自美國的Pepro Tech公司，NF-кB抗體、內參βactin抗體購自美國CST公司，Trizol購買于Invitrogen公司，PCR引物由上海英駿公司合成，RT-PCR及熒光定量PCR試劑購自TaKaRa公司，細胞因子IL-4、IL-1 β ELISA法檢測試劑盒、RIPA細胞裂解液、SOD及MDA檢測試劑盒、BCA法蛋白濃度測定試劑盒購自江蘇碧云天公司。AnnexinV/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司。

1.2細胞培養及實驗分組

A549細胞在含100U/mL鏈霉素、100U/mL青霉素、10%滅活小牛血清的RPMI-1640培養基中培養，2～3天傳代1次，取處于對數生長期的細胞用于實驗。本實驗分為實驗組和對照組。將細胞以2×10⁵/mL接種于6孔板，待貼壁細胞融合度達到70%，實驗組更換為含腫瘤壞死因子-α（10ng/mL）的培養基繼續培養，對照組未進行TNF-α刺激，24小時后分別收取培養上清及細胞標本備檢。

1.3Real-time RT-PCR檢測NNF-кB基因表達水平

TRIZOL法提取細胞總RNA，RT-PCR反應體系（20μL）：5×酶混合物4μL，RNA 1μg，DEPC水補足至20μL；逆轉錄條件：37℃，15min，85℃，5sec。real-time PCR反應體系（25μL）：2×含酶混合物12.5μL，上、下游引物各1.0μL，cDNA 2.0μL，超純水8.5μL。real-time PCR反應條件：95℃預變性30s；95℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s（40cycles）。設定在每個循環的退火期結束后程序自動記錄該循環的熒光值，以表示在該循環結束時PCR產物的量。同時擴增β-actin、NF-кB，以β-actinmRNA為參照進行相對定量，相對定量計算由Rotor-Gene Q 1.7.94軟件完成。相關引物序列見表1。

1.4免疫印跡法檢測各組細胞總蛋白NF-кB的水平

按照說明書，提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量，加入loading buffer后，金屬浴100℃，5分鐘變性后，取20ug進行SDS-PAGE電泳，電轉90min，5%脫脂奶粉室溫封閉2h，置于一抗（NF-KB抗體1：1000、內參β-actin抗體1：400）中4℃孵育過夜，TBST漂洗后，辣根過氧化物酶標記的二抗（1：2000）室溫孵育1h，TBST洗膜3次，每次10min，ECL法發光，顯影及曝光。采用QuantityOne軟件分析條帶灰度值，計算NF-кB與β-actin的灰度比值，以此表示NF-кB蛋白相對量。

1.5酶聯免疫吸附測定法檢測細胞上清液中IL-4、IL-1β的含量

收集細胞培養液，離心并取得上清，根據說明書操作，應用酶標儀測定各樣本OD值（波長450nm），根據所得標準曲線計算IL-4、IL-1β的含量。

1.6氮藍四唑比色法檢測細胞內總超氧化物歧化酶（SOD）活力

裂解各組A549細胞并測定蛋白濃度，根據說明書操作，酶標儀測定各樣本OD值（波長450nm），根據公式計算單位重量蛋白的SOD活力單位，結果以“Unit/mg蛋白”為單位表示。

1.7硫代巴比妥酸比色法檢測細胞的丙二醛（MDA）濃度

裂解各組A549細胞，測定蛋白濃度，結合說明書操作，酶標儀測定各樣本OD值（波長530nm），計算獲得標準曲線，進而計算樣本MDA濃度，除以樣本總蛋白量，即“μmoL/mg”為MDA水平。

1.8流式細胞儀檢測細胞凋亡率（AnnexinV/PI法）

收集各組細胞，根據說明書將細胞孵育染色后上機檢測，Annenxin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。根據所獲數據計算細胞凋亡率。

1.9統計學分析

應用SPSS21.0軟件包，計量資料以（xs）表示，采用兩獨立樣本的t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

統計結果顯示，實驗組NF-к B mRNA相對表達量較對照組明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組NF-кB蛋白相對表達量較對照組明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組IL-1β濃度較對照組明顯上調，實驗組IL-4濃度較對照組明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組SOD濃度較對照組明顯下降，實驗組MDA濃度較對照組明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。實驗組細胞凋亡率較對照組明顯上調，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2，圖1。

3討論

肺泡上皮細胞凋亡是ALI/RDS重要的病理生理過程之一。肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡導致呼吸膜完整性受損，肺表面活性物質無法發揮正常作用，繼而出現肺泡萎陷、微肺不張及肺水腫。因此，以肺泡Ⅱ型上皮細胞作為研究對象進行ALI模型構建具有代表性。

TNF-α是重要的前炎癥因子，在ALI炎性反應中釋放最早，能促發其他細胞因子的釋放。因此，本課題以TNF-α作為單一刺激因素，嘗試模仿急性肺損傷時的細胞炎癥-氧化損傷。IL-1β出現在急性呼吸窘迫綜合征早期，可與TNF-α協同啟動炎性反應，是重要的促炎細胞因子；IL-4是作為抗炎細胞因子，能通過抑制IL-1、TNF-α等炎癥介質的合成，或者干預某些炎癥細胞的功能而發揮抗炎作用。氧化應激也是ALI/ARDS發生、發展的機制之一，脂質過氧化生成大量新的ROS和高細胞毒性的丙二醛（MDA），測定丙二醛濃度可反應細胞損傷程度；超氧化物歧化酶（SOD）廣泛存在于生物體內，能夠催化超氧陰離子自由基發生歧化反應，是重要的氧自由基清除劑。本研究結果表明，經TNF-α刺激的A549細胞（實驗組），其促炎因子IL-1β和抗炎因子IL-4濃度上升，提示炎癥反應水平被放大；其氧化物MDA生成增加，抗氧化物SOD消耗增加，提示氧化應激失衡；實驗組細胞的凋亡率較對照組升高；上述結果均符合ALI/ARDS發生、發展過程中TNF-α啟動“瀑布式炎癥級聯反應”并繼發氧化應激、細胞凋亡的病理生理特點。

NF-кB作為經典的轉錄因子，廣泛參與了炎癥反應、免疫反應、細胞增殖與凋亡等生理病理過程。本實驗結果表明TNF-α可上調NF-KBmRNA.活化NF-кB，提示NFкB信號通路參與TNF-α誘導A549細胞產生過度炎癥反應、誘導細胞凋亡的過程。

綜上本研究以TNF-α刺激肺泡Ⅱ型上皮細胞A549，成功地在體外細胞上模擬了急性肺損傷發生時過度炎癥反應、氧化應激、細胞凋亡、細胞通路活化的病理生理過程，為急性肺損傷細胞模型研究提供參考依據。

（收稿日期：2017-08-23）