DRD3基因rs6280位點多態性與圖雷特綜合征表型的關聯分析*

圖雷特綜合征(Tourette Syndrome, TS)是一種以多種運動抽動和一種或多種發聲抽動為特征的神經發育性障礙，抽動癥狀可能同時出現也可能在疾病的不同時段先后出現，具有突發、快速、無目的、不可自控的特點且復雜多變[1]。TS病因和發病機制迄今不明，目前認為TS是遺傳因素與環境因素相互作用的結果，遺傳因素在TS的病因中起著重要作用，且TS為多基因作用的復雜疾病。神經影像學、藥理學及分子遺傳學等的證據表明TS與多巴胺系統缺陷相關[2]。國內外學者進行了大量的探討，但研究結果可重復性較差[3]。DRD3主要分布在與認知和情感等功能相關的腦區，DRD3受體在中腦邊緣多巴胺系統高表達，包括由紋狀核、中央杏仁核和NAc殼部組成的“擴展的杏仁核系統(extended amygdala) ”。DRD3基因Ser9Gly(rs6280)多態性影響D3受體的親和力，導致受體蛋白中甘氨酸替代絲氨酸。DRD3基因rs6280位點多態性已廣泛應用于神經精神疾病的遺傳病因學研究，迄今已有大量研究對其不同易感位點與精神疾病的相關性進行了探討[4]。本研究主要探討DRD3基因rs6280位點多態性與TS表型的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象 受試者為2009年12月～2015年12月就診于首都醫科大學附屬北京安定醫院兒科門診及住院的TS患者以及招募的正常兒童青少年，使用自制的臨床信息調查表進行基本資料的收集。由1位兒童精神科副主任或以上醫師按照美國精神障礙診斷與統計手冊第4版(DSM-IV)診斷標準進行診斷和臨床分型。

1.1.1 TS患者共同入組標準 (1)符合DSM-IV中TS診斷標準；(2)年齡6～18歲；(3)無其他中樞神經系統疾病及嚴重軀體疾病；(4)漢族；(5)性別不限；(6)家族史陰性；(7)能完成所有測查；(8)患者及監護人知情同意。入組全部TS患者160例，其中男128例，女32例，男∶女為4∶1；平均年齡(11.62±3.32)歲，根據是否有共患病及共患病情況進行臨床分型，結果如下：(1)單純TS患者組：共入組43例，符合TS患者共同入組標準，排除注意缺陷多動障礙(Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD)、強迫性障礙(Obsessive Compulsive Disorder，OCD)等共患病情況，無其他共患病情況；(2)TS+ADHD患者組：共入組47例，符合TS患者共同入組標準，同時符合DSM-IV中ADHD診斷標準，不符合DSM-IV中OCD診斷標準，無其他共患病情況；(3)TS+OCD患者組：共入組37例，符合TS患者共同入組標準，同時符合DSM-IV中OCD診斷標準，不符合DSM-IV中ADHD診斷標準，無其他共患病情況；(4)TS+ADHD+OCD患者組：共入組33例，符合TS患者共同入組標準，同時符合DSM-IV中ADHD及OCD診斷標準，無其他共患病情況。

1.1.2 正常對照受試者入組標準 (1)健康兒童；(2)年齡6～18歲；(3)無中樞神經系統疾病、嚴重軀體疾病及物質濫用依賴等；(4)無精神疾病且家族中無精神疾病及自殺者；(5)漢族，無血緣關系，且與TS患者亦無血緣關系；(6)性別比例與全部TS組接近；(7)能完成所有測查；(8)受試者及監護人知情同意。共納入90名受試者進入對照組，其中男73名，女17名，男∶女為4.3∶1；平均年齡(11.42±2.37)歲。

本研究報首都醫科大學附屬北京安定醫院醫學倫理委員會審批，在取得正式批準并獲得患者及家屬簽署知情同意后開展。所有受試者均對本次研究知情，受試者<7歲由監護人簽署知情同意書，受試者≥7歲由患者及監護人共同簽署知情同意書。全部TS患者性別(χ2=0.263，P=1.012)、年齡(F=1.836，P=0.231)與對照組比較，差異均無統計學意義。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 收集晨空腹外周血5 ml，乙二胺四乙酸抗凝。采用全血基因組DNA提取試劑盒(PROMEGA,美國)的離心柱法提取基因組DNA。全部DNA樣本均經濃度以及純度檢測。

1.2.2 單核苷酸多態性(SNP)的挑選 通過美國國立生物信息情報中心檢索dbSNP (Datebase of Single Nuleotide Polymorphisms, dbSNP)數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/)，國際人類基因組單體型圖(HapMap)計劃(http://www.hapmap.org/)提供的漢族人群遺傳學數據及以往文獻報道[5,6]為依據，選取DRD3的SNP位點rs6280進行基因多態性分析。

1.2.3 基因分型 采用TaqMan探針SNP基因分型技術進行DRD3 SNP位點rs6280的分型,引物和探針由美國應用生物系統公司(Applied Biosystems Inc, ABI)定制,PCR反應試劑TaqMan Universal PCR MasterMix 亦由ABI公司提供。PCR反應體系為5μL,包括模板10 ng,2×TaqMan PCRMasterMix 2.5 μL,20×SNPAssay(包括引物和FAM /VIC探針)0.25 μL。反應條件為95℃10 min；(92℃15 s, 60℃1 min)×40個循環。PCR反應和熒光信號讀取均在ABI7900HT SequenceDetector(384孔板)上完成,以SDS2.4圖像分析軟件Allelic Discrimination程序進行終點分析,通過檢測不同等位基因所標的FAM和VIC熒光強度,判斷各待測樣本基因型為野生純合子、突變純合子還是雜合子。

1.2.4 統計學方法 使用SPSS17.0軟件包進行資料的數據分析，基因型頻率和等位基因頻率使用百分率[n(%)]表示，使用Hardy-Weinberg平衡法則進行基因型及等位基因吻合度檢驗，應用χ2檢驗，比較各病例組及對照組基因多態性差異是否有統計學意義，檢驗水準為α=0.05。多組之間兩兩比較的χ2檢驗中，若與對照組比較，檢驗水準為α=0.05/(n-1)；所有組間兩兩比較，檢驗水準為α=0.05×2/n(n-1)。

2 結果

2.1 Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗結果 DRD3基因SNP位點rs6280基因型頻率在對照組(χ2=3.195，P=0.074)和全部TS組(χ2=0.302，P=0.582)，均達到Hardy-Weinberg平衡，均符合Hardy-Weinberg平衡，研究樣本具有群體代表性。

2.2 各組基因型和等位基因頻率比較 對各組基因型頻率及等位基因頻率進行比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組基因型和等位基因頻率比較[n(%)]

3 討論

TS是一類臨床癥狀復雜的神經精神發育性障礙，主要表現為運動和發聲抽動，同時可伴有其他兒童情緒行為障礙，如ADHD、OCD、焦慮、抑郁、學習障礙、自傷及傷人，甚至出現類精神分裂癥樣癥狀。目前關于TS共患病及癥狀研究分歧明顯，有觀點認為這些癥狀為TS疾病癥狀譜的一部分，另外一些觀點認為是兩種或多種疾病共患[7]。已有研究顯示，TS病因復雜，確切病因不詳。已有的影像學和解剖學研究認為基底節相關環路異常與多巴胺系統功能異常參與了疾病的發生發展，因此根據其臨床特征進行細致的臨床分型，對于不同病因學的尋找可能是有利的。

Comings DE等[5]研究顯示TS與DRD3受體基因存在關聯；而隨后Brett P等[8]及Hebebrand J等[9]的研究沒有發現TS與DRD3受體基因存在關聯。Devor EJ等[10]對16個TS家系進行研究，結果顯示DRD3受體基因多態性位點Bal I與 Msp I存在連鎖不平衡，但與TS不存在關聯。Diaz-Anzaldua A等[11]對110個核心家系進行TDT分析研究發現TS與DRD3不存在關聯。Kowalska A等[12]對TS遺傳易感進行綜述，發現DRD3基因關聯研究未得到較好的重復。

本研究團隊2015年曾進行病例對照研究顯示DRD3基因SNP位點rs6280基因型及等位基因頻率差異無統計學意義；家系研究TDT結果顯示DRD3基因SNP位點rs6280等位基因無傳遞不平衡現象[14]。導致研究結果不一致的原因可能與TS本身異質性較大有關，故在既往研究的基礎上，本研究根據TS共患病情況，對TS進行深入的臨床分型，尋找不同亞型可能的遺傳學病因。通過本次臨床分型后的進一步分析顯示，DRD3基因SNP位點rs6280在TS不同亞型患者及正常對照人群中頻率差異均無統計學意義，這提示DRD3基因SNP位點rs6280與TS及其亞型可能不存在關聯。

本研究存在的主要問題是經過具體的臨床分型，各型的樣本量較小，可能導致研究結果出現偏移。另外，主要根據主要的兩個共患病ADHD、OCD進行臨床分型，出于樣本量的考慮，沒有納入如情緒障礙、學習障礙等其他共患病進行探討；本研究僅對DRD3基因的1個SNP位點進行了研究，在多基因遺傳病中，單個基因的致病作用可能是與其他多個致病基因以及環境之間交互作用的結果。因此，未來研究應繼續擴大樣本量，探討更符合疾病特征的臨床分型，進行多個微效基因與環境相互作用的研究，以深入探討不同臨床分型的TS的遺傳機制。