湖北省煙草赤星病菌生物學特性研究

黎妍妍 楊濤 賈欣欣 鄭露 黃俊斌 許汝冰 周鵬 李錫宏

摘要：對湖北省煙草赤星病細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、鏈格孢（Alternaria alternata）、長柄鏈格孢（Alternaria longipes）和鴨梨鏈格孢（Alternaria yaliinficiens）4種鏈格孢屬致病菌的代表性菌株進行了生物學特性分析，并分析了不同溫度和保濕時間對長柄鏈格孢菌致病力的影響。結果表明，4種鏈格孢菌最適宜的生長溫度為25～30 ℃;長柄鏈格孢最適宜的pH為5～6，其他種的最適宜生長pH為6～8。在不同碳源中，以甘露醇和半乳糖作為碳源時鴨梨鏈格孢生長最快，乳糖、葡萄糖等5種碳源最適宜鏈格孢生長，長柄鏈格孢在各種碳源下均生長最慢。在不同氮源中，除長柄鏈格孢的最適氮源為氯化銨外，其他3種鏈格孢在蛋白胨作為氮源時生長最快。不同種的鏈格孢屬致病菌的致病力存在差異，除鴨梨鏈格孢菌株表現為弱致病力外，其他3種鏈格孢均存在強致病力菌株。不同溫度及保濕時間對長柄鏈格孢菌致病力具有顯著影響，最適發病溫度為25～30 ℃，保濕時間與病害嚴重度呈正相關。

關鍵詞：煙草赤星病;鏈格孢（Alternaria alternata）;生物學特性

中圖分類號：S435.72? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）22-0027-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.009? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Biological characteristics of representative strains of four Alternaria spp. （Alternaria tenuissima，Alternaria alternata，Alternaria longipes，Alternaria yaliinficiens） and the effects of temperature and wetness duration on pathogenicity of Alternaria longipes were studied. The results showed that the most suitable temperature for Alternaria spp. growth was 25～30 ℃. The most suitable pH for the growth of Alternaria longipes and the other three species were 5～6 and 6～8，respectively. When mannitol and galactose were used as carbon sources，Alternaria yaliinficiens grew fastest;And other five carbon sources，such as lactose and glucose were most suitable for the growth of Alternaria alternata;Alternaria longipes grew most slowly under all carbon sources. The effect of different nitrogen sources on the growth showed that the Alternaria longipes grew fastest when ammonium chloride was used as nitrogen source，and the other three species grew fastest when peptone was used as nitrogen source. Virulence of four species was tested，and the results showed that the virulence of four species of Alternaria spp. were different. Among them，Alternaria tenuissima，Alternaria alternata and Alternaria longipes had strong virulence strains，while the strains of Alternaria yaliinficiens showed weak virulence. Different temperatures and wetness duration had significantly influence on the virulence of Alternaria longipes. The optimal temperature for disease was 25～30 ℃，and wetness duration was positively correlated with disease severity.

Key words： tobacco brown spot disease; Alternaria alternata; biological characteristics

煙草赤星病是危害全世界煙草生產最主要的真菌性病害，其病原菌屬于半知菌類鏈格孢屬[1]。中國于1916年首次在北京近郊發現該病，20世紀80年代以來，全國煙區有日益嚴重的趨勢。1990年以后，該病在國內迅速發展成為煙草上的主要病害之一[2-5]。

煙草赤星病的發生和流行受不同環境條件的影響，其致病力在不同區域也呈現出不同的特點。劉學敏等[6]和曾琛等[7]研究發現降雨量及降雨日數、日平均溫度、日平均相對濕度、初始病情是導致其發生、暴發流行的最重要因素。很多學者對煙草赤星病鏈格孢種的致病力研究結果不同，彭希文等[8]對鏈格孢（Alternaria alternata）和長柄鏈格孢（Alternaria longipes）兩種鏈格孢屬致病菌的致病力進行了測定，發現鏈格孢的致病力強于長柄鏈格孢，且鏈格孢種間的不同菌株致病力有顯著差異。張世才[9]研究結果相反，但也有學者認為只有長柄鏈格孢菌株才具有致病力[10]。

湖北省煙草赤星病菌由細極鏈格孢（Alternaria tenuissima）、鏈格孢、鴨梨鏈格孢（Alternaria yaliinficiens）和長柄鏈格孢4個種引起[11]。其中，長柄鏈格孢是優勢致病菌，且在湖北省各個煙區都有分布。為深入了解病原菌生長、侵染及危害的特點，本研究擬通過分析不同溫度、pH、碳源和氮源對4種鏈格孢屬致病菌菌絲生長的影響，并通過分析4種鏈格孢屬致病菌的致病力差異和不同溫度及保濕時間對長柄鏈格孢致病力的影響，以期為煙草赤星病病害流行監測與防控奠定科學的理論依據。

1? 材料與方法

1.1? 供試菌株

鏈格孢（YC-WF-750-2）、細極鏈格孢（SY-FX-700-1）、鴨梨鏈格孢（ES-BD-1100-1）和長柄鏈格孢（XY-BK-800-2）4個代表性菌株，研究不同溫度、pH、氮源、碳源對菌株生長的影響。

選取17個鏈格孢屬致病菌代表菌株用于不同種致病力差異研究;5個長柄鏈格孢菌株（YC-WF-1200-3、YC-WF-1200-4、XY-BK-800-2、SY-ZS-600-2、SY-ZS-700-1）用于不同溫度和保濕時間對菌株致病力的影響。

1.2? 供試植物

采用漂浮育苗方法播種云煙87，在28 ℃光照/黑暗各12 h的培養箱中長到7～10葉期的健康煙草葉片用于致病力測定。

1.3? 不同生長條件對鏈格孢屬致病菌菌絲生長的影響

1.3.1? 不同溫度條件對菌絲生長的影響? 在生長7 d的菌落邊緣用直徑6 mm打孔器打取菌絲塊，接種于PDA培養基上，每個皿接一個菌絲塊。將平板分別置于5、10、15、20、25、30、35 ℃全黑暗恒溫培養箱中培養，培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑并記錄數據，各溫度處理重復6次。

1.3.2? 不同pH對菌絲生長的影響? 用滅菌的0.1 mol/L氫氧化鈉溶液和0.1 mol/L鹽酸溶液調節PDB培養基，pH分別為4、5、6、7、8、9、10，打取生長7 d的菌落邊緣直徑為6 mm的菌絲塊接種于PDB培養基平板中央，置于全黑暗25 ℃恒溫培養箱中培養，培養7 d后用十字交叉法測量菌落直徑并記錄數據，各處理重復6次。

1.3.3? 不同碳源對菌絲生長的影響? 以Capek培養液（0.5 g MgSO4·7H2O，2.00 g KNO3，0.01 g FeSO4，1.00 g KH2PO4，0.5 g KCl，30.0 g蔗糖，補足1 000 mL去離子水）為基礎，加15 g瓊脂，用等質量碳元素的乳糖、葡萄糖、半乳糖、甘露醇、麥芽糖、淀粉替代蔗糖，以不加碳源的培養基作為培養菌對照。接種、培養及測量方法同“1.3.2”。

1.3.4? 不同氮源對菌絲生長的影響? 以Capek培養液為基礎，加15 g瓊脂，用等質量氮元素的蛋白胨、硝酸銨、氯化銨、尿素、硝酸鉀、乙酸銨、甘氨酸替代硝酸鉀，以不加氮源的培養基培養菌作為對照。接種、培養及測量方法同“1.3.2”。

1.4? 不同種煙草鏈格孢屬致病菌的致病力測定

將4個種的17個代表性菌株轉至PDA培養基上，置于22 ℃、光暗交替的恒溫培養箱中培養，7 d后在菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌絲塊，接種到7～10葉期的離體健康煙草葉片上，在25 ℃、12 h光照12 h黑暗的恒溫培養箱中保濕培養3 d后測量接種點的病斑直徑。試驗共重復3次。

根據張明厚等[12]的分級標準來評價各菌株致病力的強弱。病害嚴重度及致病力強弱依據病斑直徑進行劃分：0，無病癥，不致病;1，病斑直徑0～0.5 mm，致病力弱;2，病斑直徑0.5～2.0 mm，致病力中等;? 3，病斑直徑2.0～5.0 mm，致病力較強;4，病斑直徑? >5.0 mm，致病力強。

1.5? 不同條件對長柄鏈格孢致病力的影響

挑選致病力強的5株長柄鏈格孢菌用于研究不同保濕時間對病原菌的致病力影響，在PDA培養基上培養7 d后，在菌落邊緣打取6 mm的圓形菌絲塊，接種在育苗桶（400 mm×300 mm×500 mm）中生長至7～10葉期的煙草葉片上。

1.5.1? 不同溫度對長柄鏈格孢致病力的影響? 分別置于15、20、25、30和35 ℃恒溫保濕、光暗交替（12 h/12 h）的培養箱中培養3 d后，統計發病情況。

1.5.2? 不同保濕時間對長柄鏈格孢致病力的影響

接種后噴水用保鮮膜密封保濕置于28 ℃、濕度75%、光暗交替（12 h/12 h）的恒溫培養箱中培養，分別在1、3和5 d后揭開保鮮膜，測量發病病斑直徑。每個菌株接種10片煙草葉片，試驗重復3次。

1.6? 數據統計與分析

試驗數據用SPSS軟件（V6.12）分析，并用最小顯著差數法（LSD）比較不同處理的顯著性差異。