真菌ＮＢＥＲＣ－１７０３０１中農藥活性化合物的研究

張亞妮 方偉 王開梅 張志剛 王燕 萬中義 吳兆圓

摘要：篩選到一株具有農藥活性的真菌NBERC-170301，通過活性跟蹤，確定出其中的活性組分。并經過大量發酵，提取分離得到4個化合物，經超高效液質聯用（UPLC-MS）和NMR確定其中3個化合物分別為青霉酸、郝金青霉素和郝青霉素酮，活性測試結果表明，化合物4對小菜蛾具有較好的毒殺活性，但結構暫未確定。

關鍵詞：真菌NBERC-170301;農藥活性;青霉酸;郝金青霉素;郝青霉素酮

中圖分類號：TQ450.1? ? ? ? 文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）22-0060-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.017? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Fungus NBERC-170301 which had pesticide activity was found. By active tracking，the active fractions were detected，and 4 compounds were obtained（1-4）. Compounds 1-3 were identified as penicillic acid（1），herqueichrysin（2） and herqueinone（3） by UPLC-MS and NMR. The results of biological activity showed that compound 4 had insecticidal activity against the Plutella xylostella L.，however，the structure of which was failed to be identified.

Key words： fungus NBERC-170301; pesticide activity; penicillic acid; herqueichrysin; herqueinone

真菌分布廣泛，從陸地到海洋，從動物到植物，乃至其他微生物，幾乎都有真菌的存在。正是由于真菌的物種多樣性與生態環境的多樣性導致了其次生代謝產物結構和生物活性的多樣性，因而一直以來都是先導化合物的重要來源之一[1，2]。據不完全統計，已有8 600多種活性代謝產物分離自真菌，具有多種結構類型。從1940年的僅10多個化合物到2002年超過22 000個化合物，期間具有活性代謝產物的數量呈指數倍地不斷增長[3]。臨床上廣泛使用的青霉素、洛伐他汀、環孢素以及棘白霉素等藥物，都是真菌次生代謝產物或其衍生物[4]。

湖北省生物農藥工程研究中心擁有豐富的微生物資源，在抗菌活性真菌的篩選過程中，篩選到一株具有農藥活性的真菌NBERC-170301，通過活性跟蹤，確定出其中的活性組分。現將試驗報告如下。

1? 材料與方法

1.1? 菌株

1.1.1? 抗生素產生菌? 編號為真菌NBERC-170301，在武漢市的土樣中分離得到，由湖北省生物農藥工程研究中心保存。

1.1.2? 生測指示菌? 番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、小麥穎枯病菌（Septoria nodorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）均為湖北省生物農藥工程研究中心保存。

1.1.3? 供試昆蟲? 小菜蛾（Plutella xylostella L.）初孵幼蟲、棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）初孵幼蟲、蚜蟲（Aphidoidea）均由湖北省生物農藥工程研究中心提供。

1.2? 培養基

1.2.1? 種子培養基? 麥芽糖6.25 g，麥芽提取物6.25 g，酵母提取物1.00 g，磷酸二氫鉀1.25 g，硫酸鎂0.625 g，蛋白胨0.625 g，瓊脂粉15.00 g，去離子水1 000 mL。

1.2.2? 發酵培養基? 葡萄糖72.00 g，蛋白胨8.00 g，酵母提取物4.00 g，磷酸二氫鉀2.00 g，硫酸鎂1.00 g，鹽酸硫胺0.10 g，pH 6.0，去離子水1 000 mL。

1.2.3? 生測培養基? 采用（PDB+瓊脂）半固體培養基，馬鈴薯（去皮）200 g， 葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，去離子水1 000 mL，自然pH。

1.3? 儀器與試劑

1.3.1? 儀器? Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內標）（德國Bruker BioSpin公司）;BUCHI ROTAVAPOR R-200型旋轉蒸發儀（瑞士）;Water 2695高效液相色譜儀（Waters 2996二級管陣列檢測器，色譜工作站MasslynxV4.0）;高效制備液相色譜儀（Waters2525泵，帶2767自動收集系統，Waters2996二級管陣列檢測器，色譜工作站MasslynxV4.0）;液質聯用儀：Waters 2695高效液相色譜系統，美國Micromass Quattro Micro？誖質譜儀電噴霧離子源（ESI），Masslynx V4.1液質聯用分析軟件。

2.3? 化合物的活性測試

按照“1.5.5”的方法對4個化合物進行殺蟲、殺菌的活性測試。化合物1在濃度20 mg/L下僅對水稻紋枯病原真菌具有較弱的抑制作用，但無殺蟲活性。化合物2、化合物3在3個濃度梯度下均無殺蟲、殺菌活性。化合物4在濃度1 000 mg/L、500 mg/L下對小菜蛾具有較好的毒殺活性，但對棉鈴蟲和蚜蟲無活性，且無殺菌活性。

3? 小結與討論

篩選到一株活性真菌NBERC-170301，經分離純化得到4個化合物，通過NMR數據分析，確定其中的3個化合物分別為青霉酸[Penicillic acid（1）]、郝金青霉素[Herqueichrysin（2）]和郝青霉素酮[Herqueinone（3）]，化合物3以一對構象異構體呈現。化合物4對小菜蛾具有較好的毒殺活性。

青霉酸主要是由軟毛青霉、圓弧青霉、馬頓青霉、托姆青霉、徘徊青霉、棒形青霉以及棕曲霉等產生的多聚乙酰類霉菌毒素。有關青霉酸的研究較多，青霉酸不僅具有抗細菌、抗真菌、抗病毒、抗腫瘤以及抑制乙酰膽堿酶的活性，且對各種動物都具有毒性，主要引起心臟、肝臟和腎臟等器官的損傷，并具有潛在致癌性[11-13]。此外，青霉酸是一種真菌群體效應抑制劑（QSI），近期人們對50種青霉屬真菌進行篩選，發現66%的菌株能產生具有QSI活性的次生代謝產物，其中的兩種主要次生代謝產物為青霉酸和棒曲霉素，以銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）為例，青霉酸和棒曲霉素能夠對銅綠假單胞菌中群體效應控制的基因進行抑制，其中青霉酸的抑制率高達60%[14]，考慮到青霉酸本身的毒性，或許進行修飾變成無毒的衍生物之后可以成為抗感染的藥物。郝金青霉素是一種新的芴酮抗生素，Narasimhachari等[8]研究表明，郝金青霉素在青霉屬Penicillinm herquei strain I菌株靜止培養的菌絲體中分離得到;濃度為1 μg/mL時可抑制枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌生長。有關郝青霉素酮的研究報道較少。活性測試結果表明，化合物4對小菜蛾具有較好的毒殺活性，但其結構中所含手型分子暫未確定，進一步將會繼續對化合物4進行結構分析，以便找到活性好的化合物。

參考文獻：

[1] TAN R X，ZOU W X. Endophytes： A rich source of functional metabolites[J].Nat Prod Rep，2001，18（4）：448-459.

[2] NEWMAN D J，CRAGG G M. Natural products as sources of new drugs over the 30 Years from 1981 to 2010[J].J Nat Prod，2012，75（3）：311-335.

[3] PELAEZ F. Biological Activities of Fungal Metabolites. In： An Z（ed）.Handbook of Industrial Mycology[M].FL，USA：CRC Press，2004.

[4] GE H M，TAN Z X. Symbionts， an important source of new bioactive natural products[J].Prog Chem，2009，21（1）：30-46.

[5] 張亞妮，王開梅，張志剛，等.放線菌WS-24926產生的刀豆霉素分離純化及含量測定[J].湖北農業科學，2017，56（24）：4787-4790.

[6] SUZUKI S，KIMURA T，SAITO F，et al. Antitumor and antiviral properties of penicillicacid[J].Agricultural and Biological Chemistry，1971，35（2）：287-290.

[7] 董杰杰，張曉勇，鮑? 潔，等.海洋真菌Aspergillus sp. SCSGAF 0076與細 菌Bacillus sp. MNMCCE001共培養次生代謝產物[J].微生物學報，2014，54（11）：1289-1295.

[8] NARASIMHACHARI N，VINING L C. Herqueichrysin，a new phenalenone antibiotic from Penicillium herquei[J].J Antibiot，1972，25（3）：155-162.

[9] SIMPSON T J. Carbon-13 nuclear magnetic resonance structural and biosynthetic studies on deoxyherqueinone and herqueichrysin，phenalenone metabolites of Penicillium herquei[J].J C S Perkin Transactions 1，1979：1233-1238.

[10] TAKAYUKI S，TAKAMITSU Y，TOSHIFUMI H，et al. 13C NMR signal assignments of herqueinone and its phenalenone derivatives[J].Bull Chem Soc Jpn，1983，56：3661-3666.

[11] KANG S W，KIM S W. New antifungal activity of penicillic acid against Phytophthora species[J].Biotechnology Letters，2004， 26（9）：695-698.

[12] SCH？譈RMANN B T M，SALLUM W S T，TAKAHASHI J A. Austin，dehydroaustin and other metabolites from Penicillium brasilianum[J].Química Nova，2010，33（5）：1044-1046.

[13] 郭? 樂，晏暉云，袁? 慧.青霉酸毒性研究進展[J].動物醫學進展，2008，29（3）：94-96.

[14] RASMUSSEN T B，SKINDERSOE M，BJARNSHOLT T，et al. Identify and effects of quorum-sensing inhibitors produced by Penicillium species[J].Microbiology，2005，151（5）：1325-1340.