杜鵑遠緣雜交后代的無菌培養研究

資宏 楊婧瑜 方林川 周媛

摘要：選用杜鵑（Rhododendron）品種♂胭脂蜜（Rhododendron obtusum ‘Yanzhimi）×♀春五寶（Rhododendron hybridum ‘Chunwubao）雜交種子作為試驗材料，研究了不同殺菌方式、不同培養基初代培養、不同生長調節劑、低溫處理及光照條件對種子萌發與生長以及添加不同濃度生長調節劑的1/2 WPM培養基對雜交無菌苗生根率的影響。結果表明，杜鵑雜交種子的最佳殺菌方式為1.5% NaClO溶液處理10 min+75%乙醇處理30 s;在經過為期20 d的4 ℃低溫處理，并添加濃度為100 mg/L GA3的1/2 WPM培養基中培養杜鵑雜交種子，其發芽率最高，達到56.7%;光照對杜鵑雜交種子的萌發起促進作用，光照處理下的種子萌發率高于黑暗處理，且種子萌發的時間提前3～7 d;添加了0.5 mg/L NAA、0.1 mg/L IBA的1/2 WPM培養基使杜鵑雜交無菌苗的生根率達到了最佳。

關鍵詞：杜鵑（Rhododendron）;低溫;無菌播種;發芽率;生根率;雜交不親和

中圖分類號：S681.9? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2018）22-0090-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.22.025? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： Taking Rhododendron cultivar "Rhododendron obtusum‘Yanzhimi×Rhododendron hybridum‘Chunwubao" as experimental materials， the effects of different methods of disinfection， initial culture of different kinds of media，different plant growth regulators， low temperature treatment and light conditions on seed germination and the growth were studied， and the effects of 8 kinds of 1/2 WPM medium supplemented with different concentrations of plant growth regulators on the rooting rate of hybrid sterile seedlings were also studied. The results showed that the optimum disinfection method for Rhododendron hybrid seeds was 1.5% NaClO solution for 10 min and 75% ethanol for 30 s. On the condition of 20 days low-temperature treatments at 4 ℃，and culturing Rhododendron hybrid seed with 100 mg/L GA3 in 1/2 WPM medium， the highest germination rate was got，and the value was 56.7%. Light irradiation promoted the germination of Rhododendron hybrid seed，the germination rate of seed under light treatment was higher than that of dark treatment，and the seed germination time was also 3～7 days earlier. On the condition of 1/2 WPM medium with 0.5 mg/L NAA and 0.1 mg/L IBA，Rhododendron hybrid sterile seedling had the highest rooting rate.

Key words： Rhododendron; low temperature; aseptic sowing; germination rate; rooting rate; cross-incompatibility

杜鵑（Rhododendron）是杜鵑花科杜鵑花屬常綠或落葉灌木，是中國的十大傳統名花之一，也是世界著名的觀賞花卉，素有木本花卉之王的稱號[1]。因其極高的觀賞價值，在園林中享有“花中西施”的美譽。中國是世界杜鵑花野生種質資源的發源地之一，是杜鵑花種群量最大的國家。全世界野生杜鵑花約1 000種，其中中國占有大約570種，包括特有種420種。而目前中國杜鵑花的園藝品種總數只有不到300種，其園藝栽培品種的培育任重道遠。

杜鵑在自然條件下可通過種子繁殖，生產上常采用扦插、嫁接等方式繁殖，但這些方式繁殖系數低，繁殖速度慢，且同時受季節、生長環境、母株材料等限制，不適于大量的商業化生產[2]。雜交選種是培育杜鵑品種最常用最有效的方法之一，由于杜鵑園藝栽培種的耐熱性很差，所以育種家期望通過野生耐熱杜鵑與栽培杜鵑的遠緣雜交獲得抗性強的杜鵑新品種，然而杜鵑屬內遠緣雜交不親和限制了這種育種手段的應用?，F有技術中杜鵑進行雜交育種時，往往重視了親本選配等合子胚形成前期的工作，但對后期的工作缺乏系統研究，限制了杜鵑雜交尤其是種間的遠緣雜交在新種質資源創制方面的運用，不利于杜鵑花種間雜交的遺傳育種工作。利用杜鵑雜交種子進行無菌播種，培育試管苗，探索其最適的種子殺菌方式、基本培養基的選擇、低溫、生長調節劑、光照等對種子萌發的影響以及不同濃度生長調節劑對繼代生根的影響，設計一種實現杜鵑花遠緣雜交與組織培養的方法，以解決杜鵑種間雜交后代種子萌發率差、成苗弱、生根不良及新品種選育周期偏長等問題，并實現杜鵑花新優種質的快速高效無菌培養，同時可以將春鵑品種的優良抗逆性性狀轉入杜鵑高觀賞性品種中。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

采用杜鵑品種♂胭脂蜜（Rhododendron obtusum ‘Yanzhimi）×♀春五寶（Rhododendron hybridum ‘Chunwubao）雜交種子，2016年11月采自中國科學院武漢植物園杜鵑種質資源圃內，干燥后收集于EP管內，室溫保存。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 田間人工雜交授粉試驗? 選擇處于氣球狀時期的大花蕾，開花前對母本進行去雄套袋，收集父本的新鮮花粉，于晴天上午9：00～12：00進行常規人工授粉，各組合至少重復50朵花，種子成熟后開裂前收集蒴果，去除果殼和雜質剝出種子，置于4 ℃冰箱干藏。

1.2.2? 種子的殺菌處理? 試驗設置2個因子，因子1為不同濃度殺菌劑，共有5個水平;因子2為殺菌時間，共有4個水平;合計有20個處理（表1），每個處理設3個重復，每個重復接種100粒種子。先將種子用吐溫20的水溶液洗滌1次，然后分別用NaClO（1.0%、1.5%、2.0%）溶液、H2O2（20%、30%）進行殺菌，隨后用75%乙醇浸泡洗滌30 s，無菌水沖洗5次，每次1 min，最后將種子接種于1/2 WPM培養基，在25 ℃下培養7 d后，記錄菌落數，計算種子污染率;培養第14天統計種子發芽情況，計算萌發率。

1.2.3? 培養基的篩選? 將杜鵑種子用相同的殺菌方式殺菌后，將種子接種于不同培養基，在25 ℃下培養，生長5周后分級統計萌發小苗的生長狀況（葉片顏色、株高、根長）。選用的培養基為1/2 MS、MS、1/2 WPM、WPM，并以H2O作為空白對照培養基。

1.2.4? 杜鵑種子萌發的誘導? 為了篩選出更適合杜鵑種子的誘導培養基，采用GA3和NAA兩種生長調節劑進行不同濃度的生長調節劑處理，以及不同時間的4 ℃低溫處理，并以低溫+生長調節劑組合處理的方法探索最合適的誘導杜鵑種子萌發的培養基處理。各處理分別為1/2 WPM+4 ℃低溫處理0 d（A1）;1/2 WPM+4 ℃低溫處理5 d（A2）;1/2 WPM+4 ℃低溫處理10 d（A3）;1/2 WPM+4 ℃低溫處理20 d（A4）;1/2 WPM+0 mg/L GA3（B1）;1/2 WPM+5 mg/L GA3（B2）;1/2 WPM+20 mg/L GA3（B3）;1/2 WPM+100 mg/L GA3（B4）;1/2 WPM+NAA 0 mg/L（C1）;1/2 WPM+0.1 mg/L NAA（C2）;1/2 WPM+0.5 mg/L NAA（C3）;1/2 WPM+1.0 mg/L NAA（C4）;1/2 WPM+4 ℃低溫處理10 d+20 mg/L GA3（D1）;1/2 WPM+4 ℃低溫處理10 d+100 mg/L GA3（D2）;1/2 WPM+4 ℃低溫處理20 d+20 mg/L GA3（D3）;1/2 WPM+4 ℃低溫處理20 d+100 mg/L GA3 （D4）。其中，A1-A4為4 ℃低溫處理;B1-B4為不同濃度GA3處理;C1-C4為不同濃度NAA處理;D1-D4為不同組合處理。

種子殺菌后，接種到以上培養基，每個培養基接種100粒種子，3個重復。在25 ℃環境下培養14 d，統計種子發芽數，計算萌發率。

1.2.5? 培養條件? 將接種后的培養基置于培養溫度為25 ℃，光照度為2 000 lx，光照時間為每天12 h的培養環境下培養。設置24 h無光照的培養條件為對照組。觀察并記錄發芽率和幼苗生長狀況。

1.2.6? 組織培養? 組培苗的快速繁殖，選取帶芽莖段，將其接種至生根培養基中，進行生根并移栽。分別將生長3個月的雜交杜鵑苗在超凈工作臺上切下莖段，每個莖段帶兩個腋芽，將莖段基部插入含不同濃度組合的IBA與NAA的杜鵑組培苗繼代培養基中，培養基基本配方為1/2 WPM+IBA+NAA+0.8%瓊脂粉+活性炭0.05%，pH 5.6，設置0、0.1、0.5 mg/L IBA和0.1、0.5、1.0 mg/L NAA不同濃度生長調節劑組合，各組合見表2。將培養基置于25 ℃條件下，暗光培養30 d后置于3 000～4 500 lx下，16 h/8 h（光/暗）光周期培養，光周期下培養60 d，觀察統計生根情況，計算生根率，3個重復試驗。

1.2.7? 各指標計算公式? 種子污染率=（污染種子數/殺菌種子數）×100%;種子發芽率=（發芽種子數/無污染種子數）×100%;繼代生根率=（生根株數/繼代總株數）×100%。

2? 結果與分析

2.1? 不同殺菌方式及殺菌時間對種子的影響

2.1.1? 不同殺菌處理對杜鵑種子殺菌效果的影響? 用20種處理組合對杜鵑種子進行殺菌處理，7 d后對種子的帶菌率進行測定，評價其殺菌效果，結果見圖1。隨著NaClO溶液使用濃度的增加，其污染率逐漸降低。同時NaClO溶液濃度為1.5%和2.0%時，其污染率隨著處理時間的延長而降低，而NaClO溶液濃度為1.0%時，其污染率在處理時間10 min時最大，隨后再隨著時間增加而降低。隨著H2O2溶液濃度和時間的增加，其污染率也有一定程度的降低。由圖1可以看出，NaClO溶液處理比H2O2溶液處理對杜鵑種子的殺菌效果好。

2.1.2? 不同殺菌處理方式對杜鵑種子的成活率和發芽率的影響? 由圖2可知，杜鵑種子在經過不同濃度和時間的殺菌方式處理后，種子的發芽率發生了很大的變化。1.0%NaClO溶液處理10 min的種子發芽率最高，但綜合圖1所示，發現該殺菌處理下的種子的污染率也是最高的。污染率最低的殺菌方式為2.0%NaClO溶液處理20 min，然而其發芽率同時也是最低的。因為殺菌效果好的殺菌劑毒性更大，浸泡時間長，種子容易受到毒害而影響發芽率。NaClO溶液處理后杜鵑種子的發芽效果比H2O2溶液處理要好，綜合圖1所示結論，確定NaClO溶液更適合作為杜鵑種子的殺菌劑。同時，經過綜合比較，得出杜鵑種子的最佳殺菌處理方式為1.5%NaClO溶液處理10 min。

2.2? 不同培養基對種子萌發的影響

由表3可知，4種培養基在一定程度上都有利于萌發小苗的生長，而WPM培養基明顯優于MS培養基。同時1/2 WPM培養基培養在葉色、株高、根長上都能穩定高效地促進小苗的生長，1/2 WPM培養基為杜鵑無菌播種的最適培養基。

2.3? 不同處理對種子萌發的誘導作用

如圖3所示，4 ℃低溫處理、GA3處理、NAA處理都在一定程度上可以促進種子的萌發。4 ℃低溫處理后種子萌發率隨處理時間延長呈先上升后下降再回升趨勢，并且在處理20 d后萌發率達到最大值，為44.7%。GA3處理下，隨著處理濃度的增加，種子萌發率升高，最高達到46.0%。NAA處理下，隨著濃度增加，萌發率呈先上升后略有下降的趨勢，0.5 mg/L NAA處理的萌發率達到最高，為41.7%。綜合可知，GA3處理后的種子萌發效果略優于NAA處理。設置GA3處理與低溫處理組合試驗，結果顯示，各組合處理種子萌發率比單一處理時有一定程度的增高，4 ℃低溫處理20 d+100 mg/L GA3處理的種子萌發率最高，為56.7%。

2.4? 光照環境對種子萌發的影響

在采取同樣殺菌液的相同殺菌處理，1/2 WPM培養基，并經過相同誘導處理條件下培養，經數據統計，黑暗處理的種子萌發受到抑制，比每天12 h光照處理下的種子萌發時間晚3～7 d，萌發率約為光照處理組的1/2（數據未列出）。

2.5? 不同生長調節劑對無菌苗生根的影響

將杜鵑無菌苗進行繼代試驗，插入到添加了不同濃度的NAA和IBA的1/2 WPM培養基中，進行暗處理光周期處理之后，無菌杜鵑苗的生根率有差異（圖4），其中，處理5和處理8組合的培養基，即同時添加0.5 mg/L NAA與0.1或0.5 mg/L IBA的培養基的生根率明顯高于其他幾種組合處理。

3? 討論

3.1? 種子殺菌方式的選擇

能否有效控制污染是杜鵑無菌播種是否成功的關鍵技術之一。植物無菌播種中的污染可分為外植體、培養基和無菌操作3個方面，其中培養基和無菌操作方面的污染目前已經得到有效控制，而外植體方面的污染是最為復雜也是最難控制的，其可能是細菌引起的，也可能是真菌引起的，且微生物可能是附生性的，也可能是內生性的。因此，找到一種快速高效的種子殺菌方法成為了無菌播種的重點。而種子殺菌過程最關鍵的是選擇合適的殺菌劑和殺菌時間。一般常用的殺菌劑主要有NaClO、H2O2、升汞、硝酸銀等，其中升汞的殺菌效果是最好的，但較難除去，對植物組織和細胞也有殺傷作用。所以本試驗選擇了相對殺菌較弱的NaClO和H2O2兩種殺菌劑。NaClO和H2O2的氧化性可以氧化掉杜鵑種皮上限制杜鵑種子萌發的物質，而NaClO的強漂白性還可以增加杜鵑種子的透光能力從而促進種子的萌發[3]。

在本試驗中，高濃度和長時間的NaClO和H2O2溶液處理均造成種子發芽率下降，這與沈羊城等[4]對山桐子種子殺菌的研究結果一致，推測原因為2種試劑腐蝕種皮，侵入種胚內部，造成種子活力下降甚至死亡。而NaClO處理下，杜鵑種子的萌發率要高于H2O2處理。其原因可能是，杜鵑種子上殘留的NaClO殺菌液將隨著培養時間的延長而分解為氯氣揮發掉，從而減輕對種子的毒害。而H2O2有輕微腐蝕作用，殺菌后會進一步加大種子儲存物質的外滲，從而降低了種子的活力[5]。

3.2? 培養基的選擇

基本培養基是植物組織培養過程中很重要的基質，為植物生長發育提供營養。由于植物的遺傳特性、生物學特性不盡相同，因此不同種植物甚至同一植物的不同組織對基本培養基的要求也不相同。

Anderson等首次對杜鵑花進行組織培養研究時，總結出可廣泛應用于杜鵑花屬組培的Anderson 培養基，隨后他對MS培養基進行了改良，稱之為Anderson的改良MS培養基[6]。Read等培養耐寒落葉杜鵑時，采用的是Read培養基[7]。楊乃博[8]選用1/4 MS培養基，成功培養出春夏鵑。針對MS培養基對木本植物培養的不足，Lloyd等[9]研制并開發出了適宜于木本植物組織培養的培養基（Woody plant medium，WPM），此培養基對培養杜鵑花科的一些木本植物非常奏效。此外，鄧百萬等[10]培養比利時杜鵑選用N6培養基，宗憲春等[11]選用B5培養基培養毛葉杜鵑與比利時杜鵑。到目前為止，培養杜鵑花廣泛選用這7種培養基。但因杜鵑的種、品種及外植體而異，究竟選用何種培養基作為基本培養基，需要由試驗來確定。

基于外植體誘導與分化培養階段沿用同種培養基進行培育的考慮，本試驗選用MS、1/2 MS、WPS、1/2 WPM 4種培養基來培養杜鵑，生長5周后對無菌苗的葉片顏色、株高、根長進行分級統計，發現? 1/2 WPM基本培養基培養出來的無菌小苗其生長勢最好，WPM培養基略微遜色，但在株高方面仍然優于MS和1/2 MS培養基的無菌小苗。鄭茜子等[12]探討了WPM和1/2 WPM培養基的優劣，結果表明1/2 WPM明顯優于WPM，且優于羅琳等[13]應用1/2改良MS培養基，這與本試驗結果相一致。

3.3? 生長調節劑及低溫處理對種子萌發的影響

生長調節劑是植物生長和發育必不可少的調節物質。采用NAA和GA3處理后發現，NAA和GA3都在一定程度上提高了杜鵑種子的發芽率，由此可見，NAA和GA3對杜鵑種子萌發都有一定的促進作用。而對比結果表明，GA3的促進效果略高于NAA，NAA為生長素類因子，能夠促進細胞伸長生長和細胞分裂，而GA3不僅可以促進細胞的生長與分裂，同時也是打破種子休眠，促進發芽的一種植物生長因子。

一般認為杜鵑種子具有一定程度的休眠性，但不同種類種子的休眠程度相差極為懸殊。成熟的種子能否萌發與種子內部生長因子的種類與含量有著直接的關系。三因子學說認為種子的休眠和發芽由赤霉素、細胞分裂素和脫落酸3因子共同調節，即萌發促進物質赤霉素、細胞分裂素和萌發抑制物質脫落酸之間的相互作用決定了種子的休眠與萌發。赤霉素是萌發必需的，在調節種子萌發中起著“原初作用”，抑制物脫落酸起著“抑制作用”，而細胞分裂素則起著“解抑作用”。赤霉素能促進由許多種不同結構引起的休眠或靜止種子的萌發，是主要的調節因子，而只有脫落酸等抑制物存在時，細胞分裂素存在才是必需的。

在GA3對杜鵑種子的萌發試驗中，隨著外源施用GA3濃度的增加，其種子萌發率也有一定幅度的增加。莫云容等[14]研究發現高濃度GA3處理能顯著提高種子萌發，金小平等[15]研究表明外源GA3可以有效提高榛子種子的發芽率，這與本試驗結果相符。GA3誘導水解酶產生，催化種子內儲藏物質的降解，如淀粉水解為糖，蛋白質水解為各種氨基酸，從而易于被胚利用，促進種子萌發[16]。

種子休眠和萌發與外部生態因子的關系也密不可分，低溫或冷處理能釋放種子休眠[17]。本試驗結果顯示，經過低溫處理后種子的萌發率隨著處理時間的增加而增加。內源赤霉素作用機理在于其能夠軟化胚周圍組織（如種皮和主乳）[18];而低溫處理能夠提高種子內源赤霉素含量[19]，從而解除休眠。于進英等[20]的研究結果顯示，低溫處理促進薰衣草種子的萌發。馬麗妍等[21]的研究顯示，低溫及GA3處理均可導致鳳丹種胚中碳氮代謝物和內源生長因子含量的變化，從而促進種子的萌發。

然而，在某些情況下，單一的低溫處理或生長調節劑處理并不能達到理想效果。研究表明，如果能將GA3處理和低溫層積處理結合起來，效果會更好。如于玲等[22]以低溫14 d結合500 mg/L GA3處理紫斑牡丹種子，其種子萌發和幼苗生長的效果最好;侯冬花等[23]研究發現，低溫與GA3綜合處理對野生甜仁杏種子萌發，提高其發芽率及胚根生長速率均有極顯著的促進作用。本試驗設置低溫+GA3處理組合，結果表明，低溫處理20 d，GA3外源施用濃度為100 mg/L時，種子的發芽率達到最高，與前人的研究中低溫結合GA3處理可以促進種子萌發的結果相一致，但對杜鵑幼苗生長的影響效果還待進一步的研究。

3.4? 生長調節劑對無菌苗生根的影響

不同濃度NAA和IBA組合在一起對杜鵑無菌苗繼代生根情況產生了不同的影響。通過對無菌苗生根情況的觀察和統計表明，添加了0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA的1/2 WPM培養基的生根率明顯高于其他濃度組合培養基，尤其是添加了0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA的培養基的生根情況達到了最佳。表明植物生長調節劑對無菌苗的生根有一定的促進作用，但是不同濃度組合生根情況有所差異。

4? 小結

種子的無菌播種技術被廣泛應用于植物繁殖中，采用種子的無菌播種可以縮短植物的育種周期，同時為后期研究杜鵑外植體的組織培養提供植物材料。目前國內對杜鵑無菌播種的研究較少，因此，本試驗以杜鵑種子為材料，探究其合適的種子殺菌方式、誘導萌發處理方式、培養環境。結果表明，采用1.5%NaClO殺菌10 min為杜鵑種子的最佳殺菌方式。1/2 WPM培養基添加100 mg/L GA3，并經過20 d的低溫處理，可以使杜鵑種子的發芽率達到最高，為56.7%。無論是黑暗條件還是光照條件，杜鵑種子均會萌發，但光照條件下的種子萌發率為黑暗處理的2倍，且萌發時間比黑暗處理提前3～7 d，說明光照會影響杜鵑種子的萌發。杜鵑繼代最適生根培養基為添加了0.5 mg/L NAA+0.1 mg/L IBA和0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L IBA的1/2 WPM培養基。

杜鵑的觀賞價值極高，但由于其繁殖困難，很多好的杜鵑品種無法在園林中應用。本試驗通過對雜交杜鵑無菌播種的培養條件及組織培養的研究，有利于野生杜鵑種質資源的收集與保護，可以快速提高其繁殖系數，優化改良杜鵑種質，對充分利用中國豐富的野生杜鵑花種質資源、豐富杜鵑花品種的遺傳基礎以及優化育種技術發揮重要的作用，這對于杜鵑花的原創性育種工作及產業的可持續發展顯得尤為重要。

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