孕二烯酮緩釋避孕微針含量及其有關物質的測定方法研究

段雪艷 馬佳男,2 寧美英* 高云華

1.國家衛生計生委科學技術研究所(北京，100081)；2. 北京協和醫學院研究生院；3. 中國科學院理化技術研究所光化學轉換和功能材料重點實驗室

孕二烯酮是屬于19-去甲睪酮系列的第三代孕激素，無雄激素和雌激素活性，表現為較強的孕激素活性，具有良好的避孕效果[1-2]。目前含孕二烯酮的上市產品主要為口服制劑，如美國惠氏公司的上市產品敏定偶就屬于復方短效口服避孕藥，需要每日服用，順應性較差[3]。微針是一種新型的透皮給藥技術，通過穿刺角質層而將藥物輸送至皮下，同時又不會觸及痛覺神經[4]。溶解微針選用可降解聚合物材料[5-7]，在針體刺入皮膚后，藥物隨著可降解聚合材料溶解在皮下組織液中，被機體吸收。本課題組以溶解性高分子材料為基質，將孕二烯酮制備成緩釋避孕微針，以達到緩釋7 d的避孕效果。為了控制微針制劑質量，需要建立靈敏度高、專屬性好的孕二烯酮含量及有關物質檢測方法。文獻報道孕二烯酮的分離及測定方法包括紫外吸光度法[7]和高效液相色譜(HPLC)法[8-10]，本文參考文獻方法[9-10]，建立了孕二烯酮緩釋避孕微針的藥物含量及其有關物質的HPLC測定法，為孕二烯酮緩釋避孕微針的體外質量控制提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

孕二烯酮原料藥(秦皇島紫竹藥業有限公司，批號92801510001)；孕二烯酮緩釋微針(自制，批號2017112801,2017112802,2017112803)；孕二烯酮標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號41008-201301)；PVPK30(博愛新開源制藥股份有限公司，批號P160307002-1)；PVPK90(博愛新開源制藥股份有限公司，批號P160305001-1)；無水乙醇(北京化工廠，批號20151008)；甲醇(fisher scientific，批號110939)；聚乙二醇400(天津市光復精細化工研究所，批號20160611)；甲醇為色譜純，水為純化水，其他試劑均為分析純。BT 224 S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；Waters 2695-2487高效液相色譜儀(美國Waters公司)；XS105電子天平(METTLER TOLEDO公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵(鞏義市英峪予華儀器廠)；RT 5 power多點加熱磁力攪拌器(德國IKA)；KH-250DE型數控超聲波清洗器(昆山禾創超聲儀器有限公司)。

1.2 HPLC條件

色譜柱為Diamonsil C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，UV檢測波長為239 nm；流動相為乙腈-水(55:45)，流速為1 ml/min，進樣量為20 μl；柱溫30℃。

1.3 溶液配制

①對照品儲備液的配制：精密稱取孕二烯酮對照品5 mg，置于25 ml量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。精密量取1 ml原液置于50 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。②供試品溶液的配制：取3片孕二烯酮微針或等量的含藥基質溶液，加入10 ml乙醇，室溫攪拌30 min，濾過，取100 μl續濾液于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為孕二烯酮供試品溶液。③自身對照溶液的配制：精密量取孕二烯酮供試品溶液100μl于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為自身對照溶液。④損失供試品溶液的配制：制備孕二烯酮緩釋微針后，將殘留含藥高分子基質溶液的槍頭置于錐形瓶中，加入10 ml乙醇，室溫攪拌30 min，濾過，取50 μl續濾液于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，作為損失供試品溶液。

1.4 專屬性

1.4.1陰性干擾試驗分別稱取3片空白微針基質和孕二烯酮緩釋微針，加10 ml乙醇，密封，超聲提取30 min，取100 μl續濾液，加流動相稀釋至刻度，搖勻，取20 μl注入液相色譜儀進行色譜分析，記錄色譜圖。

1.4.2強降解試驗取載藥微針適量，分別在下述條件下進行實驗。①酸破壞： 加1 mol/L鹽酸1 ml使其溶解，室溫放置24 h后加適量0.1 mol/L氫氧化鈉溶液調節至中性，經0.45 μm濾膜濾過，取適量續濾液加流動相稀釋，搖勻待測。②堿破壞: 加1 mol/L氫氧化鈉1 ml使其溶解，室溫放置24 h后加適量0.1 mol/L鹽酸溶液調節至中性，經0.45 μm濾膜濾過，取續濾液加流動相稀釋，搖勻待測。③氧化破壞:加3%過氧化氫溶液適量使其溶解，室溫放置8 h后，經0.45 μm濾膜濾過，取續濾液加流動相稀釋，搖勻待測。④高溫破壞:于100℃烘箱中24 h，取出后放至室溫，加入適量乙醇使其溶解，取續濾液加流動相稀釋，搖勻待測。⑤光照破壞:置于(4500±500)Lx光照條件下48 h，取出后加入適量乙醇溶解，取續濾液加流動相稀釋，搖勻待測。

1.5 線性范圍

精密稱取孕二烯酮對照品5 mg，置于25 ml量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至刻度備用。精密量取1 ml原液置于50 ml量瓶中，加入流動相稀釋至刻度，作為儲備液。分別取儲備液0.1，0.2，0.4，0.8，1.6，2.0 ml于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻、濾過，取續濾液20 μl進行HPLC 測定，以待測組分峰面積(A)對濃度(C， μg/ml)進行線性回歸。

1.6 精密度

精密稱取孕二烯酮對照品適量，配制高、中、低3個濃度的溶液(1.0,4.0和10.0 μg/ml)，分別進樣，觀察色譜圖，記錄峰面積，計算樣品的日內和日間精密度。

1.7 穩定性試驗

精密取孕二烯酮對照品適量，配制成一定溶度的溶液，分別于常溫保存24 h和4 ℃冰箱保存72 h，在上述色譜條件下進樣，觀察色譜圖，記錄峰面積，考察樣品在不同儲存條件下的穩定性。

1.8 重復性試驗

精密取孕二烯酮對照品適量，配制成一定溶度的溶液，連續進樣6次，觀察色譜圖，記錄峰面積，計算孕二烯酮峰面積的RSD，考察儀器的精密度。

1.9 定量限和檢出限

按照信噪比3:1和10:1時相應濃度的量進樣測定，測定孕二烯酮的定量限和檢出限。

1.10 回收率試驗

取3片空白微針，按照高、中、低劑量分別精密加入孕二烯酮對照品6.0，7.5，9.0 mg(分別相當于處方量的80%，100%和120%)，每組平行3份，加10 ml乙醇，于室溫攪拌30 min，濾過，移取續濾液50 μl于10 ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，取20μl進樣，記錄峰面積，計算回收率。

1.11 含量測定

取3批孕二烯酮緩釋避孕微針、含藥基質溶液，分別按照方法1.3制備供試品溶液；同時制備損失供試品溶液，取20 μl提取液進樣，記錄峰面積，根據外標法計算孕二烯酮緩釋避孕微針的標示含量，計算公式=M測定/(M基質-M損失)×100%。

1.12 有關物質測定

取3批孕二烯酮緩釋避孕微針，按照方法1.3制備孕二烯酮供試品溶液和自身對照溶液，采用方法1.2色譜條件，精密進樣自身對照溶液20 μl，調節檢測靈敏度，使主成分峰高約為滿量程的20%，分別將供試品和自身對照溶液精密進樣20 μl，記錄色譜圖至主成分保留時間的2倍，按照自身對照法計算3批孕二烯酮微針雜質總含量。

2 結果

2.1 專屬性

2.1.1陰性干擾試驗HPLC結果(圖1)表明，輔料對孕二烯酮的測定無干擾。

2.1.2強降解實驗圖2可以看出，A、B、C、D、E保留時間的色譜峰為含藥微針經過破壞后出現的新的降解產物，各雜質峰與主峰之間分離良好；F保留時間的色譜峰為空白微針經過破壞后出現的新降解產物，但不影響孕二烯酮及其有關物質的測定。表明該方法專屬性良好。

2.2 線性范圍

線性回歸方程為：A=63605C+233.82，r=0.9997。結果表明，孕二烯酮在(0.5 ～ 10.0)μg/ml線性范圍內線性關系良好。

2.3 精密度

日內精密度分別為0.10%,0.10%和0.12%，日間精密度分別為0.28%,1.47%和0.99%，儀器的精密度良好。

2.4 穩定性

常溫保存和4℃冰箱保存的RSD分別為1.96%和0.40%，表明樣品于常溫24h和4℃冰箱保存72 h的穩定性良好。

2.5 重復性

孕二烯酮峰面積的RSD為0.53%，表明儀器的重復性良好。

2.6 定量限和檢出限

孕二烯酮的定量限和檢出限分別為7.5ng/ml和2.5ng/ml。

2.7 回收率

孕二烯酮的回收率分別為96.88%，97.11%和101.3%，RSD分別為0.52%，1.68%和0.06%，平均回收率為98.4%。

2.8 含量測定

3批孕二烯酮微針的實際含量為標示含量的94.26%,101.40%和101.00%。

2.9 有關物質測定

3批孕二烯酮緩釋微針的雜質總含量分別為0.14%，0.15%和0.12%，均<1.00%。

3 討論

3.1 溶劑的選擇

孕二烯酮幾乎不溶于水，在甲醇和乙醇等有機溶劑中的溶解性較好。從環保和經濟角度考慮，采用乙醇為孕二烯酮微針的提取溶劑。本實驗結果表明，采用乙醇進行藥物提取，微針中孕二烯酮的回收率在96.88%～101.30%范圍內。

3.2 提取方法的考察

本實驗考察了超聲提取和磁力攪拌提取兩種方式、提取溶劑、提取時間和提取體積對孕二烯酮的含量和有關物質測定的影響。結果表明：磁力攪拌提取效率高于超聲提取，所以選擇磁力攪拌提取方式；乙醇和乙腈的提取效率相同，從經濟和環保角度選擇乙醇為提取溶劑；提取時間30 min高于15 min的提取效率，但是30min后的提取效率幾乎沒有變化，因此選擇提取時間為30 min；10 ml和20 ml乙醇的提取效率相同，且顯著>5 ml的提取效率，因此選擇溶劑體積為10 ml。最終采用供試品中加入10 ml乙醇，密封，室溫下磁力攪拌30 min的提取方法為最佳提取方法。

3.3 測定方法的優化

本研究通過紫外全波長掃描確定了孕二烯酮的最大吸收波長為239 nm；參閱文獻并結合預實驗，選擇具有柱壓低、選擇性好、可以改善峰形的乙腈作為有機相。通過考察不同組成比例的乙腈與水對主成分測定的影響，結果表明，乙腈：水的比例為55:45時，孕二烯酮色譜峰的保留時間和峰形為最佳。線性、精密度、穩定性和重復性等方法學的考察結果表明，該HPLC方法專屬性強，靈敏度高，且操作步驟簡便快速，可以同時測定含量和有關物質，為孕二烯酮緩釋避孕微針的進一步研究和開發提供依據。

3.4 含量測定

文獻中尚無有關緩釋微針的含量和有關物質測定方法的報道，本文對孕二烯酮緩釋避孕微針的藥物含量的測定進行了研究。微針的含量計算不同于其他制劑以往的測定方法，因為微針基質材料加入定量溶劑后，由于高分子材料的溶脹特性，基質溶液的體積會大于定量加入的溶劑體積量，導致基質溶液的實際濃度降低。此外，由于緩釋微針制備過程中會有一部分基質溶液殘留在移取器中，損失率約為50%。所以在含量測定過程中應考慮這兩個因素，否則影響緩釋微針制劑質量研究的準確性。

本研究對于孕二烯酮緩釋避孕微針的含量和有關物質研究是首例，且對于以具有溶脹性的材料為基質的微針制劑的質量控制研究具有重要的指導意義，為微針制劑的進一步研究奠定了重要的科學基礎。